碘对大鼠甲状腺BRAF基因甲基化的影响

吴 翌，许 敏，夏同佳，赵晓彤，王佑民，邓大同

碘是维持人体正常甲状腺功能的必需元素，与甲状腺功能异常、自身免疫性甲状腺炎、甲状腺肿大、甲状腺结节和甲状腺肿瘤的发生发展有关，已有文献[1-2]证实甲状腺结节和甲状腺肿瘤的发生与鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(v-raf mourine sarcoma viral oncogene homolog B1, B-raf)基因密切相关。甲状腺疾病是常见的内分泌疾病，2014年我国有超过2亿的甲状腺疾病病人，并且其患病率呈现逐年上升的趋势[3]。BRAF作为癌基因，其基因定位于人常染色体7q34 位点，对细胞周期有调控作用，与甲状腺肿瘤的发生、发展、侵袭、转移、复发和预后密切相关[4-5]。碘作为环境因素,是否通过DNA甲基化机制影响BRAF基因表达尚不清楚。该研究通过建立不同碘营养状态的动物模型，探讨碘对大鼠BRAF基因甲基化和蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 不同碘营养水平大鼠模型构建动物购于安徽医科大学实验动物中心(安徽省实验动物质量合格证：NO.340000200001326)的远交封闭群SPF级SD大鼠，35～42 d，雌性，40只，体质量150～170 g，随机均分为5组，分别为低碘组(LI组)、适碘组(NI组)、5倍高碘组(5HI组)、10倍高碘组(10HI组)、20倍高碘组(20HI组)。在安徽医科大学动物实验中心喂养，每笼4只，共10笼。实验室温度(22±2)℃，12 h昼夜交替，所有动物每日进食量限制20 g/d、饮水量20 ml/d。整个实验过程均遵循“安徽医科大学实验用动物管理和使用指南”。5组大鼠均予以低碘饲料和混有碘化钾的去离子水喂养，每只大鼠每日的总摄碘量为:LI组<1.00 μg;NI组6.15 μg;5HI组30.75 μg；10HI组61.50 μg；20HI组123.00 μg，5组SD大鼠的每日摄碘量(见表1)。每月使用代谢笼留取一次SD大鼠24 h尿液，由安徽省疾病控制中心使用ICP-MS(电感耦合等离子体质谱法)测定尿碘水平，结果显示尿碘与给碘剂量呈正相关，提示造模成功。喂养3个月后处死大鼠，留取血液和甲状腺组织标本，甲状腺组织称干重后迅速置于液氮中保存备用。

1.2 方法

1.2.1甲状腺激素测定 血清游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine，FT4)、促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)由安徽医科大学第一附属医院内分泌实验室釆用化学发光技术的竞争免疫法(美国西门子公司试剂盒)测定，应用德国西门子医学诊断有限公司化学免疫分析仪(型号: ADVIA centaur XP)。

1.2.2甲基化 采用BSP法检测，使用天根生化科技(北京)有限公司的组织DNA提取试剂盒, 按照说明书的步骤提取甲状腺组织DNA。按DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒使用说明书操作，进行DNA的亚硫酸氢钠修饰及纯化回收。DNA 亚硫酸氢盐修饰试剂盒购自德国QIAGEN 公司；组织基因组提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自于天根生化科技(北京)有限公司。使用生物信息学在线网站MethPrimer对BRAF基因启动子区域CpG岛进行分析，经预测，发现BRAF基因启动子区域具有1个CpG岛，长度为444 bp。根据BRAF基因序列设计CpG岛引物，F：5′-GAGGGTGGTTGGAGGAGAAGGAATATTTT-3′，R：5′-CCATTAAACAAAACCTATCCCTATT-3′；引物由华大基因科技有限公司合成 。扩增条件为95 ℃预变性10 min，40个热循环(94 ℃、30 s，退火30 s，72 ℃、40 s), 72 ℃延伸5 min。将目标片段割胶纯化。PCR 产物纯化后连接克隆载体，采用Generay的PGH(Lot：GV0108)作为载体，XL10-Gold 感受态进行转化、复苏和涂板。挑取质粒送北京六合华大基因科技有限公司测序，使用BiQ Analyzer v2.0对测序的结果进行对比和甲基化分析。

1.2.3免疫组化 免疫组化操作步骤如下：① 烤片：65 ℃、1 h；② 脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 15 min-二甲苯Ⅱ 15 min-二甲苯Ⅲ 15 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-85%酒精5 min-75%酒精5 min；③ 抗原修复：组织切片置于枸橼酸缓冲液中进行微波修复；④ 阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%双氧水溶液中孵育30 min，PBS冲洗3次，每次3 min；⑤ 10%山羊血清封闭：孵育30 min；⑥ 加一抗(1 ∶100)：切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜；⑦ 室温复温1 h；PBS冲洗3次，每次5 min；⑧ 加二抗：室温孵育50 min，PBS冲洗3次，每次3 min；⑨ 滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间、苏木精复染、脱水封片；⑩显微镜镜检，图像采集分析。石蜡切片免疫组化结果判读：苏木精染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。使用Image Pro Plus图像软件分析，分别计算面积、累积吸光度(integrated optical density,IOD)、吸光度差值。

2 结果

2.1 每日碘摄入量与尿碘5组大鼠尿碘中位数与碘摄入量呈正相关，提示造模成功，但是，与NI组相比，5HI、10HI、20HI组尿碘中位数并未达到相应的倍数差。见表1。

2.2 各组血清甲状腺激素和TSH水平在5组大鼠中，NI组的血清FT3最高，LI组和各HI组血清FT3 浓度较低，差异有统计学意义(P<0.05)；但LI组与各HI组比较，血清FT3水平无明显差异。与NI组比较，LI组和各HI组血清FT4略增高，但差异无统计学意义(P>0.05)；大鼠血清 TSH 各组间比较5组的血清TSH水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 甲基化分析生物信息学在线网站MethPrimer对基因启动子区域CpG岛进行分析，经预测发现BRAF基因启动子区域具有1个CpG岛，长度为444 bp。统计分析以低碘组甲基化频率及位点数为最高，但经单因素方差分析，非参数检验(K-W检验)和卡方检验比较，5组大鼠甲基化差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表1 5组大鼠尿碘检测情况

表2 各组大鼠血清甲状腺激素和TSH水平比较

与NI组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.4 免疫组化分析5组大鼠甲状腺BRAF免疫组化表达(图1)。经单因素方差分析，5组间AREA、IOD、吸光度差值比较，LI组、NI组和各HI组甲状腺组织中BRAF表达逐渐增高，差异有统计学意义(P<0.05)(表4、图2)。经两两比较(LSD法)，与NI组比较，LI组甲状腺BRAF表达较低，各HI组表达较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与5HI组比较，10NI组和20HI组表达较高，差异有统计学意义(P<0.05)(见表5)。

3 讨论

全球除冰岛外，世界各国都有不同程度的缺碘。我国是世界上缺碘相对严重的国家之一，碘缺乏病流行范围广，发病人数多，而且病情较重。为控制这一现状，WHO 推荐在全球范围内推行以食盐加碘为主的策略。我国在1996年实行了全民食盐加碘的干预措施，经过20多年的实施，国民碘营养状况得到明显改善，人体碘储备增加，碘缺乏病得到了很好的控制[5-6]。但目前我国随机人群甲状腺结节检出率高达19%～67%[7]；食盐加碘前(1961～1994年) 甲状腺恶性肿瘤检出率为0.46%, 食盐加碘后(1995～2000年)甲状腺恶性肿瘤检出率为0.69%,其中甲状腺乳头状癌在食盐加碘后所占构成比高于加碘前[8]。

表3 5组发生甲基化位点比例比较(n=8)

图1 5组大鼠甲状腺BRAF表达 DAB染色×400

表4 单因素方差分析5组间面积、IOD、吸光度差值(n=8)

图2 5组大鼠甲状腺BRAF蛋白表达量

A：免疫组化组间、面积比较；B：免疫组化组间IOD比较；C：免疫组化光密度差值比较；与NI组比较：*P<0.05

表5 5组间面积、IOD、吸光度两两比较(n=8)

续表

BRAF基因作为癌基因，与甲状腺肿瘤的发生、侵袭、转移和复发密切相关，其基因位于人体染色体7q34, 大小约190 ku , 含18个外显子，有3 个保守区域，即CR1、CR2和CR3。 其中CR1、CR2位于氨基末端，并含有调节RA催化区域的部分，CR3是激酶区域。该基因至少含有7个转录区，能编码多种蛋白质，其中包括全长约94 ku，有783个氨基酸残基的B型有丝分裂原激活的蛋白激酶依赖性激酶，属丝氨酸∕苏氨酸蛋白激酶类[9-10]。BRAF基因突变位点大多位于第1 799位点腺嘌呤替代了胸腺嘧啶，导致激酶活性片段第15位外显子上的 T1799A点突变(V600E)，BRAF中的缬氨酸(V)被谷氨酸(E)替代[11]，从而持续激活BRAF激酶，造成MAPK通路持续活化，细胞不断分裂增殖，进而形成甲状腺肿瘤。

碘作为环境因素，其摄取量的多少可能参与了甲状腺疾病的发生。本实验通过不同碘含量饮用水成功构建不同碘营养水平的大鼠模型，结果显示NI组、LI组和各HI组仅血清FT3水平有统计学差异。BRAF是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，在MAP激酶通路的信号转导中发挥作用，主要底物为MEK1和MEK2，其致癌作用是通过Ras-Raf-Mek-Erk通路激活所介导的[12-13]，BRAF高表达可能参与甲状腺上皮细胞的过度增生。基因甲基化发生在CpG岛上，CpG岛是围绕基因调控区聚集，从未影响基因自身的转录调控。本研究利用免疫组化技术发现随着碘摄入量的增多，LI组到HI组面积、IOD、吸光度逐渐增高，差异有统计学意义，说明碘可以影响大鼠甲状腺BRAF蛋白的表达，但碘对甲状腺BRAF基因启动子区域CpG岛的影响在5组大鼠间未见异常。提示碘对甲状腺BRAF蛋白表达的影响可能不是通过BRAF基因的甲基化途径，而表观遗传学除DNA甲基化外，还有组蛋白修饰、非编码RNA等途径，所以，需进一步对其他途径进行探索。