室内臭氧对循环系统炎症因子EGF及Fractalkine的影响——随机双盲交叉试验

孙岩岩，黄婧，赵岩，李宏宇，薛丽君，刘琪思婧，曹寒，吴少伟，张玲

随着我国经济的飞速发展，大气污染物排放量急剧增加。O3的化学前体氮氧化物（NOx）和挥发性有机物（VOC）的排放，导致我国O3污染情况日趋严重[1]。2012年我国发布的GB3095-2012《环境空气质量标准》，将大气细颗粒物（PM2.5）、一氧化碳和O3作为新污染物纳入城市环境检测标准。作为全球范围内的主要大气污染物，O3对人类健康的影响，已成为当前的研究热点。近年来，我国许多城市PM2.5年均浓度已呈下降趋势。但是，O3的日均浓度却在逐年升高。Wang等[2]分析了京津冀地区13个城市的O3检测数据，其结果显示，2014～2017年均O3浓度呈上升趋势，春夏季节O3污染情况较秋冬季节更为严重。同样，有研究者发现，2013～2017年我国东北地区夏季日均O3浓度在逐年升高。大量的流行病学研究发现，短期和长期O3暴露均会增加心血管系统疾病、呼吸系统疾病和死亡风险[3-7]。O3具有强氧化性，其暴露会引起呼吸系统的氧化损伤，并进一步引起免疫炎症反应。动物及人类研究均发现，O3能够引起呼吸道炎性细胞的浸润以及炎症因子浓度升高[8,9]。然而其生理学致病机制仍不清楚，故本研究旨在探究中国北京地区室内O3对健康青年人群循环系统炎症因子水平的影响，为进一步阐明O3的致病机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象课题组于北京大学招募健康大学生作为研究对象。研究对象的纳入标准包括：①年龄介于18～30岁之间的健康大学生；②研究期间不会离开北京市（包括洗脱期）；③体质指数（BMI）＜30 kg/m2。 排除标准：①吸烟及既往吸烟者；②慢性呼吸系统疾病史者；③心血管疾病史；④急性感染者；⑤近一个月有用药史者。

1.2 研究设计本研究采用随机双盲交叉试验设计，根据研究对象的宿舍号将研究对象随机分为两组，分别接受为期一周的高效滤过空气净化器干预及无效空气净化器干预，经过至少2周的洗脱期后，两组干预方式对调并接受干预为期一周。鼓励所有的研究对象在研究期间除必要的户外活动，如上课和食堂就餐，尽可能地在宿舍活动，并保持门窗紧闭和空气净化器的持续运行。所有干预措施将在周二早8：00开始，并持续到次周周二早8：00，以避免昼夜节律的影响。干预期间要求研究对象记录其每天的时间-活动模式。每个试验阶段的最后一天对受试者进行体格检查，检验炎症因子的水平并进行统计学分析，以评估室内O3对上述血液学指标的潜在影响。

1.3 问卷调查本研究使用自填式问卷收集研究对象的个人信息，包括姓名、性别、年龄、宿舍楼号等。所有研究内容均已得到北京大学伦理委员会的批准（批准号：IRB 00001052-17090）。所有研究对象均已签署知情同意书。

1.4 生物样本的采集与检测该研究于2017年11月14日至2018年4月19日期间开展，并于每阶段的最后一天早8:00进行体格检查体检。采用EDTA抗凝真空采血管，收集每位研究对象空腹静脉血液样本5 ml，静置30 min，以3000 转/min离心10 min，分离血浆，保存至-80℃冰箱用于后续指标检测。本研究使用默克公司人细胞因子检测试剂盒HCYTMAG-60K-PX38，检测血浆EGF（epidermal growth factor）及Fractalkine。该试剂盒基于Milliplex多因子检测技术，将流式检测技术和液相芯片技术有机结合，以荧光微球为反应载体，在Luminex仪器平台上实现多种细胞因子高效定量检测，并使用配套软件xPONENT分析各检测因子浓度。所有样品均设置复孔，试验流程严格按照相应操作手册进行。

1.5 污染物暴露测量研究期间，将DustTrak TMⅡ 8530型可吸入颗粒物分析仪（美国TSI公司）及2B TechnologiesO3监测仪置于研究对象宿舍内，实时监测PM2.5和O3浓度。此外，记录研究期间室外环境国控点大气PM2.5实时浓度。同时收集研究期间北京市固定监测站点PM2.5每小时实时浓度数据。结合研究对象记录的时间活动模式从而计算出其每日个体PM2.5暴露浓度。

1.6 统计分析方法应用Epidata 3.0软件编制录入数据库，双人双录完成；使用SAS 9.4软件进行统计分析。采用t检验比较干预期与对照期室内O3及PM2.5浓度差异；使用混合效应模型评估室内O3暴露对血浆EGF及Fractalkine的影响。由于EGF及Fractalkine浓度不服从正态分布，故在分析前将浓度进行对数（log10）转换。控制受试者性别、年龄、BMI、星期几效应、各研究阶段室内温度及相对湿度。所有检验采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象基本情况本研究共有70名研究对象入选，其中3名因个人原因于研究期间退出，最终有67名完成，其中男性26名，女性41名。研究对象的平均年龄为（21.40±2.03）岁；体质指数（21.18±2.41）kg/m2；静息坐位收缩压为（107.33±8.61）mmHg，收缩压为（61.93±7.07）mmHg。

2.2 室内污染物检测结果研究期间对照期与试验期室内O3日均浓度分别为10.52 μg/m3和8.38 μg/m3，两组间的差异有统计学意义（P=0.046）。研究期间对照期与试验期个体时间加权PM2.5暴露水平分别为37.21 μg/m3和22.26 μg/m3，组间差异有统计学意义（P=0.006）。室内日均气温为27.21℃，室内日均相对湿度为25.79%（表1）。

2.3 血浆炎症因子检测结果各指标检测浓度如表2 所示。研究对象血浆中表皮生长因子（EGF）的浓度范围为1.95～180.59 pg/ml，平均水平为22.35 pg/ml；神经趋化蛋白（Fractalkine，CX3CL1）的平均水平为37.09 pg/ml。

2.4 O3短期暴露对血浆炎症因子的影响控制性别、年龄、BMI、星期几效应、研究期间室内平均温度和室内相对湿度后，研究对象体格检查当天O3暴露对两种炎症因子浓度的影响均无统计学意义。单日滞后效应中，体格检查前1日（lag1）、4日（lag4）、5日（lag5）、6日（lag6）以及滑动平均滞后1日 （lag01）和2日（lag02）的室内O3暴露与血浆中EGF和Fractalkine的升高有显著关联（P＜0.05）。其中，效应最强的为lag5，O3浓度每升高10 μg/m3，血浆EGF和Fractalkine浓度分别升高43.62% （95%CI：20.26%～71.51%）和50.04%（95%CI：22.42%～83.89%)（P＜0.001）（表3）。

表1 研究期间室内污染物日均浓度及气象因素描述

2.5 敏感性分析为探究O3效应的稳定性，故在基本模型的基础上矫正个体时间加权PM2.5暴露水平。总体而言，调整PM2.5后，O3与结局指标的关联强度有所降低。体格检查前4日（lag4）、5日（lag5）、6日（lag6）的室内O3暴露与血浆EGF和Fractalkine水平升高显著关联。关联最强的由基本模型中的lag5变为lag6。矫正PM2.5后，室内O3滑动平均暴露与血浆两种因子的浓度均无显著关联（P＞0.05，表3）。

3 讨论

本研究发现，北京地区室内O3短期暴露会升高健康青年人群血浆EGF、 Fractalkine及MCP-3浓度。对EGF及Fractalkine的影响效应更为突出，且矫正PM2.5后，O3的效应仍较稳定。提示EGF和Fractalkine可作为O3短期暴露的早期生物标志物。

大气污染物急性暴露可增加心血管系统疾病

表2 研究对象血浆EGF及Fractalkine的浓度（n=67）

表3 不同滞后时间O3每升高10 μg/m3导致炎症因子的变化百分比

的发生和死亡风险[10]。目前普遍认为大气污染物引起局部炎性因子释放、炎性细胞浸润、上皮细胞损伤等炎症性病理改变[11]，O3作为一种氧化型污染物，也可通过系统性炎症产生健康损伤效应。EGF是一种促分裂素，能有效地促进细胞增殖，参与上皮细胞的增生、成熟和分化，在上皮组织的维护及修复中起到重要作用。Polosa等人开展的一项人体暴露试验研究结果显示，短期O3暴露可引起鼻腔上皮细胞EGF及其受体浓度显著升高[12]。本研究显示，健康青年人群在O3短期暴露后，血浆中EGF浓度显著升高，提示O3在体内可能诱导了炎症反应并造成一定程度的内皮损伤。

当机体发生炎症反应时，炎性趋化因子表达量迅速上升[13]。Fractalkine是一种具有黏附和趋化活性的趋化因子，对单核细胞、T细胞等免疫细胞具有强烈的趋化作用，促进其向炎症部位的定向迁移，引起炎性因子水平升高，加剧炎症反应[14]。有学者对小鼠进行24 h O3暴露试验，结果显示，肺内Fractalkine水平升高[15]。同时，有报道称Fractalkine在动脉粥样硬化的形成及发展中均存在过度表达，并表明Fractalkine与其受体的结合将引起血管内皮的损伤[16]。本研究结果显示，O3可引起免疫能力更好的健康青年人循环系统趋化因子Fractalkine水平的显著升高，且效应具有一定的滞后性。该结果在一定程度上证实炎症反应机制在O3的病理损害过程中发挥着重要的作用，趋化因子可作为潜在的标志物进行臭氧早期健康损害的识别，但本研究结果需要在儿童及老年人群中进一步验证。

综上所述，室内O3短期暴露对血浆EGF及Fractalkine水平有显著的滞后效应。但由于本研究样本量的限制，结果的稳定性及特异性仍有待进一步探讨。