阿托伐他汀对大鼠心肌梗死后心肌纤维化的干预作用

陈仕毅，陈晓茹，刘羽，刘少奎

导致心肌梗死后心肌重构以及心脏功能障碍因素众多，心肌纤维化是关键因素之一，与死亡密切相关，其是一个渐进的过程，给社会和家庭带来沉重的经济负担。逆转心肌重构、抑制心肌纤维化可能是改善心肌梗死预后的重要靶点，但心肌梗死后心肌纤维化的机制尚不完全明确。有研究表明periostin蛋白及转化生长因子β1（TGF-β1）mRNA在多种病因所致心肌纤维化发生、发展中起到了重要的作用[1,2]。心肌梗死后心肌纤维化是否与其及信号通路相关，目前研究较少。本研究通过建立大鼠急性心肌梗死模型，观察阿托伐他汀药物治疗对心肌梗死大鼠心肌组织periostin蛋白及TGF-β1mRNA的表达水平，探讨阿托伐他汀药物在急性心肌梗塞（AMI）后逆转心肌重构、抑制心肌纤维化的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及模型建立6～8周龄雄性SD大鼠60只，体重160～180 g，购自大连医科大学实验动物中心。在室温20 ℃～25 ℃的动物房中饲养3 d后，雄性SD大鼠随机分3组：正常组（Sham）20只、单纯心肌梗死组（MI）20只、心肌梗死联合阿托伐他汀组（Ato）20只。

建立AMI模型：参照文献制备大鼠心肌梗死模型[3,4]：MI组和Ato组大鼠分别予以异丙肾上腺素85 mg/（kg·24 h）皮下注射，连续2 d。行心电图检查见ST段抬高，病理性Q波形成，提示造模成功。Sham组予以等量的生理盐水皮下注射，查心电图提示无变化。第2次异丙肾上腺素皮下注射完成4 h后予以Ato组大鼠阿托伐他汀钙5 mg/（kg·d）灌胃，Sham组和MI组等量生理盐水灌胃，连续8周。第3 d MI组及Ato组大鼠继续予以异丙肾上腺素注射液2 mg/（kg·d）皮下注射制大鼠心肌纤维化[5,6]模型，Sham组予以等量的生理盐水皮下注射，连续14 d。

8周处死大鼠，称量3组大鼠体重（BW），开胸取心脏，置于生理盐水中清洗，剥离并剪去心脏周围组织及大血管，滤纸吸干后，称取心脏质量（HW），计算HWI（HWI=HW/BW），做为判断心肌肥厚的标志。沿室间隔将心脏一分为二，取部分心间组织于10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋切片，留做HE染色，观察心肌病理改变及心肌纤维情况；Masson染色观察并计算心肌纤维化中胶原纤维的容积分数（CVF）；另一部于液氮中保存，留做RT-PCR用，检测periostin蛋白和TGF-β1 mRNA的表达情况。

1.2 主要试剂与仪器阿托伐他汀（ Pfizer Co.,Ltd）。PCR扩增试剂盒（Shanghai shenggong Co., Ltd）、DNA Marker（Shanghai shenggong Co., Ltd）、UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒（Shanghai shenggong Co., Ltd）、M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒（Shanghai shenggong Co., Ltd）、引物合成（Shanghai shenggong Co.,Ltd）。高速微型离心机（DGW99）型（深圳市点晶科学仪器有限公司）、紫外分光光度计（上海美析仪器有限公司）、DY-300型低压电泳仪（汕头市医用设备厂有限公司）、电热恒温水浴箱（海跃进医疗器械厂）、低压电泳仪（DYY-8C）（北京市六一仪器厂）、基因扩增仪（TCXP-E）（杭州博日科技有限公司）、凝胶扫描成像系统（Gel 2020D） （Binta 公司分析软件）恒温石蜡箱、石蜡切片机、电子显微镜（大连大学附属中山医院病理科提供）。

1.3 RT-PCR检测各组心肌组织中periostin蛋白及TGF-β1的表达8周分别取MI组及Sham组及Ato组大鼠的心肌组织，依据RT-PCR试剂说明书，按步骤分别检测periostin蛋白及TGF-β1的表达量。①提取RNA：称取不少于30 mg的心肌组织，将研磨后的心肌组织置于离心管中并加入RLT Solution后震荡混匀，离心并吸取上清液加入无水乙醇后混匀，使用吸附柱及DEPC-treated ddH2O获得RNA溶液。②RNA纯度的测定：使用DEPC处理水将提取的RNA稀释，使用紫外分光光度计测定A260值及A280值。用DEPC-Treated ddH2O作为空白对照。③RNA反转录：将提取的RNA加入Oligo（dT）及RNase-free ddH20后混匀并离心，65℃温浴5 min，冰浴30 s，离心。再加入Reaction Buffer、RNase Inhibitor、dNTP Mix、M-MuLV RT，混匀后离心。在PCR仪上进行cDNA合成（45 ℃），终止反应（72 ℃）。④RT-PCR：cDNA产物加入上游Primer、下游Primer、Taq DNA Polymerase等试剂，通过变性、退火、延伸等步骤进行扩增，periostin蛋白、TGF-β1、β-actin退火温度分别为54 ℃、60℃、54 ℃。⑤PCR产物检测：PCR产物用1%琼脂糖凝胶溶液进行电泳，在紫外观测仪上观察电泳结果，采用凝胶成像系统拍照并分析条带。光密度灰度扫描后图片经 Image J软件分析，结果以检测基因/β-actin的积分光密度比值表示。计算出 TGF-β1、periostin mRNA 的相对表达量。⑥引物设计：TGF-β1、periostin蛋白和β-肌动蛋白（β-actin）基因序列通过 GenBank获得，由上海生物工程有限公司合成提供（表1）。

表1 引物系列及反应条件

1.4 病理切片取左心室冠状面中部切片，置于4%的多聚甲醛溶液中固定10 h石蜡包埋待用。按5 μm厚切片随机取3张切片进行观察，切片HE染色（苏木精和Masson染色法）。

1.5 统计学分析采用SPSS 22.0统计学软件数据处理，平均数±标准差（±s）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析检验，两组间数据比较采用t检验。结果以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型结果造模过程中MI组大鼠死亡2只，Ato组死亡1只，考虑为心肌梗死后心力衰竭致死。结果为Sham组大鼠20只，MI组18只，Ato组19只。

2.2 心电图变化和各组间HWI比较异丙肾上腺素皮下注射第2 d心电图检查见MI组和Ato组大鼠Ⅱ导ST段明显向上抬高。及病程进展心电图动态演变过程；心电图设置走纸速度为50 mm/s（图1）。开胸取心脏后见MI组大鼠心脏较Sham组明显增大，心脏重量/体重（HWI）明显增大，差别具有显著意义（P＜0.01）；与AG组相比，Ato组HWI明显减低（P＜0.05）；与Sham组相比，Ato组HWI略增大，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组HWI值（表2）。

图1 A：造模前 B：造模第二天 C：造模两周后

表2 各组心脏重量指数（HWI）比较（±s）

表2 各组心脏重量指数（HWI）比较（±s）

组别 Sham组 Ato组 心肌梗死组HWI（mg/g） 3.221±0.357 3.452±0.312ac 4.088±0.513ab

2.3 HE染色大鼠心肌细胞的病理改变Sham组心肌细胞未见明显病理改变；MI组可见细胞核排列紊乱，部分细胞核消失，胞质呈粗颗粒状，心肌纤维横纹断裂明显，排列紊乱，可见大量炎性细胞；而Ato组可见心肌细胞排列相对整齐，纤维断裂明显减少，纤维化有所减轻，心肌细胞炎性坏死明显减少（图2）。

2.4 Masson染色观察心肌纤维化情况Sham组未见胶原纤维形成；MI组可见大量成簇及散在的胶原纤维形成、堆积；Ato组可见少量散在的胶原纤维形成；MI组及Ato组CVF均明显高于Sham组（P＜0.01）；而Ato组CVF明显低于MI组 （P＜0.05），（图3、表3）。

2.5 RT-PCR结果分析与Sham组相比，MI组和Ato组的TGF-β1及periostin蛋白表达量均显著增加（P＜0.01）；与MI组相比，Ato组TGF-β1及periostin蛋白的表达量显著下降（P＜0.05）（图4）。

3 讨论

目前心肌梗死已然成为严重危害人类身心健康的公共卫生问题，不但致死率高，还大大降低了患者的生活质量。虽然急诊经皮冠状动脉介入治疗（PCI）技术愈加成熟，大大降低了急性心肌梗死的死亡率。但是心肌梗死后坏死心肌的炎症反应、存活的心肌细胞肥大、间质纤维化，心室收缩及舒张功能障碍，心脏顺应性进行性下降仍然不可避免，最终大部分患者还是因急、慢性心力衰竭导致死亡。他汀类药物调脂、稳定斑块作用于心肌梗死预后的疗效已经明确，但其抑制心肌梗死后心肌纤维化的可能机制尚存在多种争议。

图2 各组心肌细胞HE染色结果 （×400）（A：Sham组 B：Ato组 C：MI组）

图3 各组心肌组织Masson染色结果（×400）（A：Sham组 B：Ato组 C：MI组）

表3 各组大鼠心肌胶原容积分数（CVF）结果（±s）

表3 各组大鼠心肌胶原容积分数（CVF）结果（±s）

注：CVF：心肌胶原容积分数；与Sham组比较， aP＜0.001；与MI组比较，bP＜0.05

组别 Sham组 Ato组 MI组CVF 8.102±2.722 36.719±10.691ab 48.001±3.234a

图3 各组心肌组织TGF-β1及periostin mRNA表达（1 Sham组；2 MI组；3 Ato组）；与Sham组相比，aP＜0.01；与MI组相比，bP＜0.05

本研究应用异丙肾上腺素注射所致大鼠心肌梗死后心肌纤维化模型，结果显示，心肌梗死组大鼠HWI较正常组明显升高，心肌组织病理染色及Masson染色均提示有明显纤维化发生，胶原纤维沉积明显增多，说明发生了心肌梗死后心肌纤维化及心室重构。在心肌梗死初期的炎症阶段，TGF-β1在心肌梗死区大量被激活以促进坏死心肌细胞完成瘢痕修复过程，起到防止心脏发生破裂的作用；但是随着心肌重构的病程进展，TGF-β1不仅在梗死区心肌细胞大量表达，在非梗死区心肌细胞中也可通过自分泌或旁分泌持续表达，出现恶性循环，导致非梗死区心肌的损伤、纤维化形成[7]。本实验提示在心肌梗死（MI组）TGF-β1的表达较Sham组是明显增高的，与Sovari等[7]研究结果一致；而他汀药物干预（Ato组）较MI组是降低的，P＜0.05。阿托伐他汀是一种新型羟甲基戊二酰单酰辅酶A还原酶抑制剂，除了调脂以外，还有抗炎、降低TGF-β1的作用[8]。田艳等研究也发现了阿托伐他汀可降低大鼠扩张心肌病心肌细胞TGF-β1的表达，改善心肌纤维化[9]。本实验提示阿托伐他汀可降低心肌梗死后TGF-β1的表达。但是，Paige等发现仅TGF-β本身增加并不出现心肌的纤维化，只有导致periostin蛋白水平上调后才会出现心肌纤维化的表现[10]。而periostin蛋白的过度表达将加重心肌纤维化，恶化左室重构，成为心肌梗死后心力衰竭的病理基础。periostin，又名骨膜素，是一种近年发现的分泌型可溶解性细胞外基质（ECM）蛋白的一种，是细胞外基质蛋白家族的新成员，是由成纤维细胞分泌的，参与细胞粘附。TGF-β1是ECM平衡的主要调节剂，通过诱导心肌成纤维细胞中各种ECM蛋白的表达，促进纤维化形成发挥关键作用[11]。Shimazaki等[12]检测纯化后的心肌细胞和心肌成纤维细胞显示：periostin蛋白绝大部分在心肌成纤维细胞中表达，并由其直接分泌，在纤维化条件下表达明显。通过本研究，我们观察到经过阿托伐他汀处理过的大鼠（Ato组）较MI组大鼠TGF-β1、periostin蛋白的表达均是明显降低的；同时通过心肌Masson染色，我们观察到经过阿托伐他汀处理过的大鼠（Ato组）较MI组大鼠心肌纤维化程度是明显降低的；并且我们也观察到经过阿托伐他汀处理过的大鼠（Ato组）较MI组心脏重量指数（HWI）也是明显改善的。进一步证实了阿托伐他汀降低心肌纤维化的同时也抑制了MI组大鼠TGF-β1、periostin蛋白的表达。因此，我们推测阿托伐他汀能够改善心肌重构、降低心肌纤维化的作用与其对TGF-β1/periostin信号传导通路的调节相关。

综上所述，本实验研究结果表明：阿托伐他汀可减轻心肌梗死后大鼠心肌纤维化、改善心肌重构，该作用机制可能与其抑制TGF-β1/periostin信号传导通路有关。但对其这一作用的具体药理机制仍需进一步研究。