实时荧光PCR方法与痰涂片法检测结核杆菌的价值分析

梁斌

结核病是结核分枝杆菌感染所致慢性传染性疾病，可发生于多个脏器，以肺结核最为多发[1]。早期快速、精确检测出结核杆菌为控制结核病的关键[2]。目前分离培养仍然是检测结核杆菌的金标准[3]，但检测所需时间长，效率低，可能延误最佳治疗时机。痰涂片为传统结核杆菌检测方法，具有简单、易行优势，但检出率很低。随着检测技术的发展，PCR检测法开始应用于临床当中，其优势在于检测速度快、成本低[4]。本次研究基于我中心结核门诊实际，以分离培养为金标准，对比分析实时荧光PCR法和痰涂片法检测结果，以期明确实时荧光PCR法的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2019年2月我中心结核门诊接诊的临床症状、体征以及胸部CT检查高度疑似肺结核患者95例，其中男59例，女36例；年龄29～73岁，平均年龄(40.05±6.91)岁。采集患者合格晨痰标本8～10 mL，密封后及时送检，若不能及时检测需置于4 ℃保存，保存时间不超过6 d。

疑似肺结核判定标准：以陈灏珠等主编的《内科学》第8版中疑似肺结核的定义为标准，符合以下任意一条定义为疑似肺结核：持续≥3周有咳嗽、咳痰症状，或咯血、痰中带血；痰涂片抗酸杆菌检测呈现阴性，伴有或不伴有咳嗽、咳痰、全身结核中毒，胸部影像学检查疑似活动性结核病变。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器 抗酸染色液、营养添加剂、杂菌抑制剂均购自厦门海菲生物技术有限公司，Xpert MTB/RIF (结核分枝杆菌rpoB基因和突变检测试剂盒) 购自天津仪美科技有限公司，MGIT培养管购自美国BD公司微生物公司，Vortex gene2漩涡震荡仪购自河北润创科技开发有限公司，GeneXpert购自天津仪美科技有限公司。

1.2.2 痰涂片检测 取出载玻片，以竹签蘸取0.05～0.10 mL的干酪样、脓样痰液标本，将竹签上的标本涂抹于载玻片右侧2/3中央位置，涂抹范围为2.0 cm×2.5 cm，形成椭圆形痰膜，放置于自然环境中晾干，加热固定，行抗酸染色镜检：在玻片上滴加1滴石碳酸复红染色液，微火加热，出现蒸汽后停止加热，以蒸馏水水洗；以0.5%浓度盐酸酒精做脱色处理，至没有红色染料脱落为止，以蒸馏水水洗；碱性美兰复染，持续20～60 s，以蒸馏水水洗；用吸水纸吸干后用油镜进行镜检。结果判定，阴性：持续观察300个视野均未见抗酸杆菌；阳性：持续观察300个视野后发现单个或多个抗酸杆菌，其中300个视野中有1～8条抗酸杆菌为(+)，100个视野中有3～9条抗酸杆菌为(++)，10个视野中有1～9条抗酸杆菌为(+++)，任意视野中抗酸杆菌数均≥10条为(++++)。

1.2.3 实时荧光PCR检测 采集5 mL痰液标本，以12 000 r/min的速度离心处理5 min，倒出上清液，保留离心处理后的沉淀物，使用无菌移液管吸取0.5 mL痰沉淀物至圆锥形、带螺旋盖的试管中，添加1.5 mL 样品处理剂(SR)充分震荡10 ～20次，室温下放置15 min，再次震荡10～20次，使样品液化。以试剂盒中的无菌移液管吸取足量液化样本(样本液面在移液管最低标记处)，打开XpertMTB/RIF检测匣，缓慢倒入检测液，盖紧盖子，启动GeneXpert检测仪进行检测，至检测反应结束后取出检测匣，在系统中查看检测结果，Ct值代表DNA浓度，Ct值≤28为阳性。

1.2.4 MGIT960液体分离培养 以50 mL离心管取2 mL痰液，并加入2 mL浓度4%的氢氧化钠(NaOH)，充分涡旋震荡，放置于空气中30 min，并加入40 mL PBS溶液，监测混合液pH值，中和至6.8时，以12 000 r/min的速度离心处理5 min，倒出上清液，保留离心处理后的沉渣。在离心管中滴入0.5 mL生理盐水，以吸管吹打沉淀物，使其完全混匀，留待接种。取MGIT培养管，并加入0.8 mL的营养添加剂、杂菌抑制剂的混合液，取0.5 mL留待接种样本，将其接种于MGIT培养管中，静置于BACTEC MGIT-960 Tb中培养。在显微镜下观察菌落生长情况，阳性判定标准参考痰涂片检测。

1.3 观察指标 统计痰涂片法、实时荧光PCR法、MGIT960液体分离培养法检测结果，并以MGIT960液体分离培养法结果为金标准，对比实时荧光PCR法、痰涂片法检测准确性、敏感度、特异度。

1.4 统计学方法 采用统计学SPSS 23.0软件分析研究数据，计数资料采用率表示，行χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。采用Mcnemar检验分析检测结果，采用Kappa检验分析一致性，K≥0.75为一致性较好，0.4≤K＜0.75为一致性中等，K＜0.4为一致性较差。

2 结果

2.1 痰涂片法、实时荧光PCR法、MGIT960液体分离培养法结核杆菌阳性检出率比较 痰涂片法结核杆菌阳性检出率为29.47%(28/95)，实时荧光PCR法检出率为37.89%(36/95)，MGIT960液体分离培养法检出率为38.95%(37/95)，三种检测方法结核杆菌阳性检出率比较，差异无统计学意义(χ2=2.239，P＝0.326＞0.05)。

2.2 痰涂片法、实时荧光PCR法检测结果与金标准比较(表1) 痰涂片法检测结果与MGIT960液体分离培养法结果对比差异无统计学意义(P ＞0.05)，与MGIT960液体分离培养法结果一致性中等(K＝0.467)。

实时荧光PCR法检测结果与MGIT960液体分离培养法结果对比差异无统计学意义(P ＞0.05)，与MGIT960液体分离培养法结果一致性较好(K＝0.933)。

2.3 实时荧光PCR法、痰涂片法检测准确率、敏感度、特异度比较(表2) 实时荧光PCR法检测准确率、敏感度均高于痰涂片法，对比差异有统计学意义(P＜0.05)，两种检测方法特异度比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 实时荧光PCR法、痰涂片法检测准确率、敏感度、特异度比较 单位：%

3 讨论

结核病具有传染性强、危害性大等特点，若未及时治疗可损伤呼吸系统，影响患者各项生理机能，甚至危及生命[5]。寻找快捷有效的结核病诊断手段能够尽早明确患者病情状况，指导临床制定有效防治方案。

液体分离培养法为结核杆菌检测金标准，但是结核杆菌的细胞壁结构特殊，其对营养物质的吸收速度慢，导致菌落生长缓慢，普通培养基需要3～8周，而快读培养基也需要7～10 d，其检测耗时长[6]，会延误早期诊断、治疗时间，并不是理想的检测手段。痰涂片法是结核杆菌检查中最常用的手段，具有操作简单、易于施行、对检测人员水平要求不高等优势[7]。但是痰液标本中除了含有结核杆菌外，多含有其他非结核杆菌，而其他杂菌也会使抗酸染色，形成假阳性，而有些患者则因结核杆菌抗酸染色不明显而漏诊，检测准确性不能得到保证，敏感度、特异度差，误诊率高。随着分子生物学的发展，学界开始关注从分子生物角度分析结核杆菌，实时荧光PCR检测法应运而生。实时荧光PCR检测法通过检测结核杆菌DNA来判断患者是否有结核杆菌感染，进而诊断其是否有结核病[8]。实时荧光PCR的应用为提升结核杆菌早期检出率提供可能。实时荧光PCR法原理为：将荧光反应物加入PCR反应体系当中，使其和PCR扩增物关联，以扩增反应体系中荧光强度为依据定量分析特定DNA，既能够避免检测过程中受污染问题影响，又能够提升检测速度、检测敏感度、特异度，且实现了自动化定量分析，其适用范围广泛，在无法进行病原微生物培养及培养困难的病原菌检测中普遍应用[9]。

本次研究中实时荧光PCR法、MGIT960液体分离培养法结核杆菌阳性检出率稍高于痰涂片法，但差异无统计学意义(P＞0.05)，实时荧光PCR法检测结果与MGIT960液体分离培养法一致性较好(K＝0.933)。痰涂片法检测结果与MGIT960液体分离培养法结果一致性中等(K＝0.467)。实时荧光PCR法检测准确率、敏感度均高于痰涂片法(P＜0.05)，证实实时荧光PCR法具有良好应用价值[10]。

另外，笔者在临床当中发现实时荧光PCR法检测效率高，且检测费用相对较低，患者普遍可以承担，因此具有推广可行性。综合分析实时荧光PCR法的临床检验时间情况，笔者认为将实时荧光PCR法作为结核杆菌的检测方法更有助于提升结核病的检出率，指导临床采取有效防治措施。需要注意的是实时荧光PCR检测也存在假阴性、假阳性病例，其原因在于此种检测方法能够对结核杆菌DNA进行定量分析，但无法辨别活性菌和死菌，因此会在一定程度上影响检测结果，因此PCR检测法适用于肺结核早期筛查，而不能作为确诊依据。

综上所述，实时荧光PCR检测结核杆菌的检出率高，诊断准确率、敏感度高，与液体分离培养法一致性较好，其应用价值高于痰涂片法，可推广应用。