通络驻景丸对糖尿病大鼠血-视网膜屏障保护作用的机制研究

雷晓琴，周云云，李雨薇，宋虎平，任翠翠

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最为常见和严重的微血管并发症之一，是成人致盲的最常见的病因之一[1]。DR 早期以视网膜血管瘤、出血、渗出为主；晚期出现新生血管、增生性病变、视网膜脱离，严重影响患者生活和工作[2]。近年研究表明，血-视网膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)的破坏是该病变的主要病理学基础。在DR 病变过程中，由于BRB 的破坏，引起视网膜出血、渗出，导致视网膜病变的发生发展[3]。紧密连接（tight junction,TJ） 是BRB 的重要组成部分之一，TJ 的分子结构包含多种跨膜蛋白，研究较多的有咬合蛋白Occludin和带状闭合蛋白ZO-1。这些蛋白的表达量、位置、结构变化及表达功能的降低或增加等，最终都会影响TJ 的粘接性能，并最终影响BRB 的功能。因此，可以通过研究视网膜的白蛋白（Albumin）渗漏、咬合蛋白（Occludin）、带状闭合蛋白ZO-1 的表达水平以及Occludin mRNA 含量来反映BRB 的功能。

通络驻景丸是在中医药理论的指导下，结合长期的临床经验形成的治疗DR 肝肾阴虚兼有血瘀证的协定方[4-5]。本实验在前期临床和动物实验研究基础上[6-7]，用链脲佐菌素（STZ）建立动物模型，并设计使用一组含有梯度浓度通络驻景丸药液进行干预，通过检测视网膜的Albumin 渗漏，视网膜组织中Occludin、带状闭合蛋白ZO-1 的表达水平以及Occludin mRNA 含量，揭示通络驻景丸对血-视网膜屏障的保护作用，为其治疗DR 提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量180～220 g，购于西安交通大学医学部实验动物中心，许可证号：SCXK（陕）2017-003。

1.2 主要实验试剂与仪器

STZ（Sigma 公司，美国）；5×SDS 蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒（西安赫特生物科技有限公司）；PVDF 膜（Millipore 公司）；总RNA 提取试剂盒、Prime Script RT Master Mix (Perfect Real Time) 试剂盒、SYBR Premix Ex Taq II (TliRNase H Plus)试剂盒（Takara 公司）；罗氏血糖仪和卓越金锐血糖试纸（罗氏诊断有限公司，德国）。高速冷冻离心机HC-3018R（科大创新股份有限公司）；倒置相差显微镜BX53（Olympus 公司，日本）；生物显微成像系统DP72 （Olympus 公司，日本）；超低温冰箱SANYO（SANYO 公司，日本）；电泳仪JY300C（北京君意东方电泳设备有限公司）。

通络驻景丸（组成：熟地黄、菟丝子、车前子、三七、蒲黄、砂仁、地龙等）以汤剂形式在临床上应用，故在前期工作中就对其水提取工艺采用正交试验的方法确定了最佳工艺条件为： 以上药材除砂仁外的其余7 味药材加10 倍量水，煎煮40 min，后下砂仁，再煎煮10 min，滤取药液。药渣再加8 倍量水，煎煮30 min，滤取药液。合并两次煎液，即得。为给药方便，将药液浓缩为100 mL（即生药量0.78 g/mL）。动物实验时，根据动物与人体表面积换算法分高、中、低剂量组给药。

1.3 造模和分组

健康雄性SD 大鼠75 只，适应性饲养1 周，采用随机数表法将大鼠分为5 组：空白组（NC 组），模型组（DM 组），通络驻景丸低、中、高剂量组（TLP-L组、TLP-M 组、TLP-H 组），每组15 只。按1%浓度将STZ 溶解于新鲜配制的柠檬酸缓冲液中，60 mg/Kg体质量腹腔注射诱发糖尿病。NC 组按60 mg/Kg 体质量腹腔注射柠檬酸缓冲液，其余大鼠腹腔注射STZ 造模。整个过程无菌操作，10 min 内完成。注射后30 min 恢复进食。72 h 后大鼠尾静脉采血测量血糖，剔除随机血糖低于16.7 mmol/L 的大鼠。DM 组和NC 组大鼠给予蒸馏水，TLP-L、TLP-M 和TLP-H组分别按照通络驻景丸1.65、3.33、6.66 g 生药/Kg灌胃给药，给药容积2 mL/100 g 体质量。每日灌胃1次，连续12 周。

给药结束后用乌拉坦麻醉大鼠，立即摘取眼球，将眼球置于显微镜下，从角巩膜缘处切开眼球，取出晶状体和玻璃体，视网膜与脉络膜及巩膜组织出现分离，显微剪轻柔进入视网膜下，从视乳头部向前轻轻挤压，将完整的灰白色视网膜组织分离。将分离出的视网膜组织装入EP 管，并进行低温保存（-80℃），用于后续实验。

1.4 视网膜组织Albumin 渗漏检测

充分暴露大鼠心脏，用生理盐水行心脏灌注术除去体循环内的血液，然后摘取大鼠眼球用于视网膜组织中Albumin 渗漏检测。

1.5 Western blot检测视网膜组织Albumin、Occludin、ZO-1 的蛋白表达水平

装有视网膜的EP 管中加入组织蛋白裂解液，玻璃匀浆器对视网膜组织手动匀浆30 s，静置30 min，全程冰上操作。充分裂解后转移至另一预冷离心管中，12000 rpm，4℃离心15 min，取上清液即为总蛋白。按照BCA 蛋白试剂盒的说明，绘制BCA 标准曲线，测定蛋白浓度。配置分离胶和浓缩胶，取蛋白样品作SDS-PAGE 电泳，上样，电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗孵育过夜，TBST 洗涤，二抗孵育2 h，TBST 洗涤，显影，保存条带。用Image-Pro Plus 对以上获得的蛋白条带进行OD 值测定，完成蛋白表达量的定量分析。计算方法为：蛋白表达量=×100%。

1.6 视网膜Occludin mRNA 表达的测定

采用实时定量荧光PCR 法测定大鼠视网膜组织内Occludin mRNA 表达的影响。Trizols 试剂提取视网膜总RNA，取RNA 样品用1×TE 缓冲液稀释样品适当倍数，用核酸浓度测量仪测浓度和纯度。取RNA2μg 进行反转录，生成的产物cDNA 保存于-20℃备用。Real-time PCR 应用Thermal Cycler Dice Real Time System 扩增仪，检测目的基因的相对表达采用SYBR Green I 染料两步法，反应条件的优化是用所有cDNA 产物等体积的混合样试验。反应条件如下：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，共40 个循环。Occludin mRNA 表达以β-actin 为内标来测算。使用Primer5.0 软件设计引物，引物序列见表1。相对表达量2－△△Ct 计算公式如下：△△Ct=（Ct目的基因-Ct内参基因）模型组-（Ct目的基因-Ct内参基因）正常组。

1.7 统计学方法

用SPSS 17.0 统计软件分析，各组数据均为计量资料，用均值±标准差（）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）方法，组内两两比较应用LSD-t检验。若P＜0.05，则认为差异有统计学意义。

表1 相关目的基因和内标基因的引物序列

2 结果

2.1 视网膜组织中Albumin 的渗漏

5 组间Albumin 的蛋白含量比较，F=241.518，P=0.000，有统计学意义。两两比较，DM 组Albumin的蛋白含量明显高于NC 组（t=26.956，P=0.000），有统计学意义。与DM 组相比，TLP-L、TLP-M 和TLP-H组Albumin 蛋白含量有显著降低，均有统计学意义（tTLP-H=21.596，tTLP-M=10.210，tTLP-L=6.861，均P=0.000）（图1，表2）。

2.2 视网膜组织Occludin、ZO-1 的蛋白表达水平

Occludin 蛋白表达：5 组间比较，F=255.438，P=0.000，有统计学意义。两两比较，DM 组与NC 组相比，视网膜组织中Occludin 的蛋白含量降低（t=27.795，P=0.000），有统计学意义。TLP-H 和TLP-M 组与DM组相比，Occludin 的蛋白含量均有不同程度升高（tTLP-H=14.216，tTLP-M=6.679，均P=0.000），均有统计学意义。而TLP-L 组与DM 组比较，t=1.907，P=0.086，无统计学意义。

ZO-1 的蛋白表达：5 组间比较，F=130.453，P=0.000，有统计学意义。两两比较，DM 组与NC 组相比，视网膜组织中ZO-1 的蛋白含量降低，t=19.386，P=0.000，有统计学意义。TLP-H 和TLP-M 组与DM组比较，均有统计学意义（tTLP-H=11.498，tTLP-M=5.694，均P=0.000）。而TLP-L 组与DM 组比较，t=0.857，P=0.412，无统计学意义（图1，表2）。

2.3 视网膜中咬合蛋白Occludin mRNA 表达

图1 Albumin、Occludin 和ZO-1 的蛋白表达情况

表2 各组大鼠视网膜中Albumin、Occuldin 和ZO-1 蛋白表达量(,n=3)

表2 各组大鼠视网膜中Albumin、Occuldin 和ZO-1 蛋白表达量(,n=3)

注：* 与正常对照组比较，P＜0.05。# 与模型组比较，P＜0.05。TLP-L：通络驻景丸低剂量组；TLP-M：通络驻景丸中剂量组；TLP-H：通络驻景丸高剂量组；Albumin：白蛋白；Occludin：咬合蛋白；ZO-1：带状闭合蛋白-1；β-actin：β-肌动蛋白

5 组间比较，F=15.013，P=0.000，有统计学意义。两两比较，与DM 组相比，通络驻景丸给药组Occludin mRNA 含量均有不同程度升高，TLP-H 组和TLP-M 组中Occludin mRNA 的含量有显著升高，差异有统计学意义 （tTLP-H=4.845，PTLP-H=0.001；tTLP-M=3.835，PTLP-M=0.003），而TLP-L 组与DM 组比较，t=1.615，P=0.137，无统计学意义（图2）。

图2 视网膜Occludin mRNA 表达情况

3 讨论

目前，DR 的发病机理尚不十分清楚，但BRB 的破坏是DR 标志之一，是引起黄斑水肿进而造成糖尿病患者失明的最常见原因[8]。血-视网膜屏障（BRB）像血脑屏障一样，可以阻挡血管内血液成分、大分子物质和毒性物质渗漏到视网膜，以维持光学介质的透明性，维持最佳的视网膜水合作用和视网膜厚度，维持视网膜微环境的动态平衡。因此，完整的BRB是维持视网膜正常的结构和功能所必需的。BRB 分为内屏障（iBRB）和外屏障（oBRB）。iBRB 和oBRB的重要组成部分之一是紧密连接（TJ），BRB 的通透性与TJ 的结构状态密切相关。正常情况下视网膜内屏障可阻止血管内液体和大分子物质渗漏到视网膜，外屏障则阻止脉络膜毛细血管血液渗漏到视网膜[9]。各种原因，如缺血、糖代谢异常、炎性细胞因子的释放、玻璃体以及视网膜前膜的机械牵引等都可以对血-视网膜屏障造成破坏，导致血管内液体及大分子物质渗漏到细胞外间隙，形成视网膜水肿，后期引起异常的血管生成、出血，最终导致视力损害或失明。

Albumin 是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40%～60%，细胞外液中仅有极微量的存在。正常的血-视网膜屏障可阻止视网膜血管中Albumin 渗漏到细胞间隙中，心脏灌注后可清洗掉血管内未粘附的Albumin，检测视网膜剩余Albumin的含量，可作为评估视网膜渗漏的一种方式[10]。在本实验中，糖尿病模型组大鼠的视网膜的Albumin 渗漏量明显高于空白对照组，而通络驻景丸高剂量组渗漏量显著低于模型组，展示出高剂量的通络驻景丸对于糖尿病大鼠血-视网膜屏障的保护作用。

TJ 是内、外屏障的结构和功能的基础，对维持上皮细胞间的极性，控制水、大分子、细胞及其他分子进行选择性细胞旁通透，维护机体内环境的稳定性和维持BRB 的完整性起决定性的作用。TJ 由多种蛋白构成，其分子结构包括多种跨膜蛋白（包括咬合蛋白Occludin、闭合蛋白Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3）和紧密连接周边蛋白（包括带状闭合蛋白ZO-1，ZO-2,ZO-3、扣带蛋白等） 和连接黏附分子JAM 等。这些蛋白的表达量、位置、结构变化及表达功能的降低或增加等，最终都会影响TJ 的粘接性能。在众多蛋白中，Occludin 是TJ 的主要蛋白，相邻的Occludin 形成的闭锁小带是TJ 的关键部分。ZO-1的N 端直接结合于Occludin 的C 端，将Occludin 与细胞骨架相连。因此，Occludin、ZO-1 对TJ 结构和功能的稳定性方面起重要作用[11-12]。已有研究发现，Occludin、ZO-1 在DR 大鼠视网膜中表达降低[3]。相关研究发现，糖尿病时BRB 通透性增加与Occludin表达减少有关，大鼠在注射STZ 3 个月后发现视网膜匀浆中Occludin 的含量减少了约35%[13]。本实验中，用STZ 诱导的糖尿病大鼠中，与模型组相比，通络驻景丸给药组大鼠视网膜组织Occludin、ZO-1 的蛋白表达水平及Occludin mRNA 表达水平均有不同程度的升高，其中通络驻景丸高剂量组升高最多。这些结果与前人实验结果一致，表明通络驻景丸具有通过提高视网膜紧密连接蛋白中的咬合蛋白Occludin、带状闭合蛋白ZO-1 的表达水平和Occludin mRNA 含量，进而起到保护血-视网膜屏障的作用，抵御DR 的进一步发展。

驻景丸首见于宋代官修方书《太平圣惠方·卷第三十三·治目昏暗方》，具有补益肝肾，清肝明目的作用，是治疗眼科疾病的常用方。基于对驻景丸、加减驻景丸、驻景丸加减方的深入研究、临床应用和动物实验的不断探索总结的基础上，创制形成通络驻景丸[14]。方中含熟地黄、菟丝子、车前子、三七、蒲黄等药，具有滋阴活血、化瘀止血、通络明目之效，稳定血管内环境，发挥减轻DR 病症的作用[15]。本研究显示通络驻景丸可以通过提高紧密连接蛋白中的咬合蛋白Occludin、带状闭合蛋白ZO-1 的表达，进而增强BRB，提示通络驻景丸对BRB 的保护效应。另外课题组目前仅研究了通络驻景丸对Occludin、ZO-1 两个主要蛋白的影响，至于通络驻景丸对其他紧密连接蛋白的影响，仍需下一步深入研究。