石窑当归提取物对卵巢早衰大鼠的改善作用及Rictor/mTORC2信号通路的影响▲

梁 欢 付 楝

[恩施土家族苗族自治州中心医院中医部(恩施州民族医院)妇科，湖北省恩施市 445000，电子邮箱：lianghuan9731@163.com]

卵巢早衰是指卵巢功能衰竭所导致的40岁之前即闭经的现象，特点是40岁以下女性的卵巢功能停止，闭经，低雌激素和促性腺激素水平升高，伴有不同程度的低雌激素症状，如潮热多汗、面部潮红、性欲低下等[1-3]。卵巢早衰的灾难性后果是生育能力下降，这是由于大多数情况下没有卵泡，而在其他情况下剩余卵泡无法对激素刺激做出反应[4-5]。目前，调节原始卵泡激活、卵泡生长、卵泡存活或闭锁过程所涉及的因素和机制尚未明确。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的机制靶标是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其形成两种不同的功能性复合物，即mTOR复合物(mTOR complex，mTORC)1和mTORC2[6-7]。磷脂酰肌醇3-激酶信号传导在卵泡发生过程中具有重要意义，包括卵泡激活、发育和存活；作为磷脂酰肌醇3-激酶的下游靶标，mTORC1参与卵泡发生的调节[8]。mTORC2的必需核心包含mTOR、哺乳动物应激激活蛋白激酶相互作用蛋白、哺乳动物致死性SEC13蛋白8和雷帕霉素不敏感亚基Rictor。抑制mTORC2可导致整个原始卵泡池功能的抑制，可引起卵巢早衰和不孕[9]。但Rictor/mTORC2在卵泡发生中的作用目前尚不清楚。

石窑当归具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效，用于治疗血虚萎黄、眩晕心悸、月经不调、经闭痛经、虚寒腹痛、肠燥便秘、风湿痹痛、跌扑损伤、痈疽疮疡[10]。本研究拟探讨石窑当归提取物对卵巢早衰大鼠的防治作用及Rictor/mTORC2信号通路的影响，为卵巢早衰的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要药物、试剂及仪器 石窑当归提取物(纯度99.99%；湖北中医药大学提供，批号：SK-0609)；己烯雌酚(原料药，纯度99.99%；湖北远成赛创科技有限公司，批号：190413)；环磷酰胺(美国Sigma公司，批号：M6025)；雌二醇、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)试剂盒(美国贝克曼库尔特公司，批号：AW1258、XS6598、MN5287)；TRIzol试剂、反转录试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：14896、K1622)；PrimeScript RT-PCR试剂盒(宝日医生物技术北京有限公司，批号：R0933)；放射免疫沉淀测定裂解缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、增强的化学发光检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，批号：SC1063-5、C5039、SF1452-3)；二喹啉甲酸蛋白质浓度测定试剂盒(中科瑞泰北京生物科技有限公司，批号：RTP7102)；兔抗人Rictor、mTORC2多克隆抗体(德国Sigma-Aldrich公司，批号：SAB1409702、SAB2456987)；兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗体、多克隆山羊抗小鼠辣根过氧化物酶二抗(英国Abcam公司，批号：ab8245、ab7023)。贝克曼AU-480全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特公司)；CX31光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；NanoDrop 2000分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)；LightCycler 480实时荧光定量PCR系统(瑞士罗氏公司)。

1.2 实验动物及分组 清洁级Wistar雌性大鼠100只，16周龄，体重250～300 g，贵州医科大学实验动物中心提供[动物生产许可证号：SCXK(黔)2019-0001；动物使用许可证号：SYXK(黔)2019-0012；动物质量合格证号：00019041308]。按随机数字表法将大鼠分为对照组、模型组、己烯雌酚组、石窑当归提取物低剂量组(低剂量组)、石窑当归提取物高剂量组(高剂量组)，每组20只。动物自由摄取饲料、自由饮水，自动控制昼夜循环(12/12 h)，室温(22±1)℃。

1.3 动物造模及给药 取模型组、己烯雌酚组、低剂量组、高剂量组大鼠，腹腔注射环磷酰胺30 mg/kg，1次/d，连续5 d。注射第5天后对大鼠行阴道细胞涂片1次，观察分析大鼠动情周期的变化，出现动情周期紊乱表示模型建立成功[11]。建模成功后，己烯雌酚组给予灌胃10.0 mg/kg的己烯雌酚(将己烯雌酚和生理盐水配置成浓度为1.0 mg/mL的溶液，灌胃体积为10 mL/kg)；低剂量组、高剂量组给予灌胃20.0 mg/kg、40.0 mg/kg的石窑当归提取物(将石窑当归提取物和生理盐水配置成浓度为2.0 mg/mL、4.0 mg/mL的溶液，灌胃体积为10 mL/kg)；对照组、模型组灌胃等体积(10 mL/kg)生理盐水。均1次/d，持续给药4周。给药结束后，股动脉取血3 mL,4℃ 5 000 r/min离心5 min获取血清进行相关指标的检测；随后颈椎脱臼处死大鼠，获取卵巢组织用于后续研究。

1.4 血清FSH、LH、雌二醇水平测定 使用AU-480全自动生化分析仪及相应试剂测定血清雌二醇、FSH、LH水平，按照说明书步骤进行操作。

1.5 卵巢病理结构观察 取大鼠卵巢组织，经乙醇脱水，石蜡包埋后，制成4 μm厚的石蜡切片，进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，显微镜下观察卵巢组织病理结构变化。

1.6 卵巢组织Rictor和mTORC2 mRNA表达水平测定 将卵巢组织(100 mg)在液氮中研磨成粉末，并与1 mL TRIzol试剂混合后使用苯酚氯仿法提取总RNA。使用紫外分光光度法检测RNAA260/A280比值后获取RNA的纯度。使用反转录试剂盒，在37℃下将1 μg RNA反转录为 cDNA，并在-20℃下储存。使用PrimeScript RT-PCR试剂盒，使用U6作为内参照，进行RT-PCR，测定Rictor、mTORC2 mRNA的相对表达水平。引物由宝日医生物技术北京有限公司合成。Rictor正向引物为5′-AGCTGGUGTTGTGAATCAGGCCG-3′，反向引物为5′-GGTACTGUGTTGTGAACCTGATC-3′；mTORC2正向引物为5′-AACTGATGTGAATCCTGA-3′，反向引物为5′-TTGAGCGUGAAGTACCCTGA-3′；U6正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物为5′-CCGTGATCAGTTGCCA-3′。反应体系(20 μL)：10 μL qPCR混合物、1 μL引物、1 μL cDNA和8 μL ddH2O。反应条件：在95℃初始变性10 min，然后95℃ min，60℃ 30 s，共40个循环。使用2-ΔΔCt方法计算Rictor、mTORC2 mRNA相对表达水平。每个样品按一式三份进行测试。

1.7 卵巢组织Rictor、mTORC2蛋白表达水平测定 将卵巢组织在液氮中研磨成粉末，并将100 mg粉末与含有1%苯甲基磺酰氟的100 μL预冷放射免疫沉淀测定裂解缓冲液混合，在4℃下裂解过夜。然后将混合物在4℃下1 000 r/min离心15 min。用二喹啉甲酸蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。然后将蛋白质样品(50 μg)与十二烷基硫酸钠混合，加缓冲液后在沸水浴中变性10 min。将样品在100 mV电压下行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。成功分离蛋白质后在冰上转膜1 h，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉在室温下封闭1 h。然后用兔抗人Rictor(1 ∶1 000稀释)、mTORC2(1 ∶1 000稀释)和GAPDH(1 ∶5 000稀释)多克隆一抗在4℃孵育过夜。用含有吐温20的磷酸盐缓冲盐水洗涤膜5次，5 min/次，将膜与多克隆山羊抗小鼠辣根过氧化物酶二抗(1 ∶10 000稀释)在室温下孵育1 h。用含有吐温20的磷酸盐缓冲盐水洗涤膜5次，5 min/次。然后使用增强的化学发光检测试剂盒显影，于Image Lab v3.0成像软件获取和分析成像信号。根据GAPDH条带灰度值计算Rictor、mTORC2蛋白的相对表达水平。

1.8 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，比较采用单因素方差分析，多重比较采用SNK-q检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清雌二醇、FSH、LH水平比较 与对照组比较，其余4组大鼠雌二醇水平降低，FSH、LH水平升高(P<0.05)；模型组、低剂量组、高剂量组、己烯雌酚组雌二醇水平依次升高，FSH、LH水平依次降低(均P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠血清雌二醇、FSH、LH水平比较(x±s)

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与己烯雌酚组比较，cP<0.05；与低剂量组比较，dP<0.05。

2.2 各组大鼠卵巢病理结构变化 对照组卵巢结构正常，可见原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡，黄体较多，分布均匀；模型组卵泡排列松散紊乱，早期、次级、成熟卵泡明显减少；己烯雌酚组、石窑当归提取物低及高剂量组成熟卵泡增加，可见原始卵泡和大量初级卵泡、次级卵泡，黄体较多。见图1。

图1 5组大鼠卵巢病理结构变化(HE染色，×400)

2.3 各组大鼠卵巢组织Rictor、mTORC2 mRNA和蛋白水平比较 与对照组比较，其余4组大鼠卵巢组织Rictor和mTORC2 mRNA、蛋白相对表达水平均降低(均P<0.05)；模型组、低剂量组、高剂量组、己烯雌酚组卵巢组织Rictor和mTORC2 mRNA、蛋白相对水平依次升高(均P<0.05)。见表2及图2。

表2 5组大鼠卵巢组织Rictor、mTORC2 mRNA和蛋白相对表达水平比较(x±s)

与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与己烯雌酚组比较，cP<0.05；与低剂量组比较，dP<0.05。

图2 5组大鼠卵巢组织Rictor、mTORC2蛋白表达水平

3 讨 论

女性的生殖寿命最终取决于卵巢原始卵泡池的大小，卵巢原始卵泡池的大小通常在胚胎发育期间或出生后确定。为了产生用于受精的成熟卵母细胞，通过由卵泡激活的过程将原始卵泡从休眠卵泡的储库募集到生长的卵泡池中，随后进行一系列的发育步骤[12]。在整个过程中，如果没有选择进一步生长，大量卵泡会发生凋亡性死亡(闭锁)。当原始卵泡池耗尽时，会发生更年期或卵巢早衰。

石窑当归为我国传统中草药，具有补血、活血、调经止痛、润燥滑肠的功效，其主血虚诸证、月经不调、经闭、痛经、症瘕结聚、崩漏、虚寒腹痛、痿痹、肌肤麻木、肠燥便难、赤痢后重、痈疽疮疡、跌扑损伤[13-14]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠雌二醇水平降低，FSH、LH水平升高；模型组、低剂量组、高剂量组、己烯雌酚组雌二醇水平依次升高，FSH、LH水平依次降低(P<0.05)。这说明石窑当归提取物能改善卵巢早衰大鼠紊乱的性激素水平，且高剂量的作用效果更为明显。己烯雌酚为非甾体雌激素，具有雌激素作用。己烯雌酚可改善如潮热、烦躁失眠、阴道干燥等卵巢早衰症状，高剂量组FSH、LH水平略高于己烯雌酚组，这提示石窑当归提取物高剂量可获得与己烯雌酚更为相似的卵巢早衰改善作用。此外，病理学结果显示，模型组卵泡排列松散紊乱，早期、次级、成熟卵泡明显减少；而己烯雌酚组、石窑当归提取物低、高剂量组成熟卵泡增加，可见原始卵泡和大量初级卵泡、次级卵泡，黄体较多。这提示石窑当归提取物能促进卵巢早衰大鼠卵泡发育、成熟。

静息原始卵泡受局部细胞因子抑制以保持休眠。磷酸酶和张力蛋白同系物、卵母细胞中的结节性硬化复合物1和结节性硬化复合物2是维持原始卵泡静止的抑制机制的一部分[15]。mTORC1在卵母细胞中不断被抑制，并且可因mTORC1活性的选择性升高而导致原始卵泡的选择性激活[16]。相反，mTORC2在卵母细胞中持续表达以维持卵泡存活，并且当mTORC2在拮抗条件下(例如卵毒素诱导的损伤或存活因子缺陷)被抑制时卵泡细胞凋亡增强[17]。总之，卵母细胞中的mTORC1信号传导和mTORC2信号传导协同作用以调节卵泡激活、发育和闭锁。研究表明，Rictor/mTORC2信号通路对于多基因靶向促进小鼠的胎儿生长具有重要调控作用[18-19]。Rictor可调节细胞生长、增殖和代谢，其激活后促进两个下游靶标(即p70核糖体S6激酶1和真核起始因子4E结合蛋白-1)的磷酸化，并刺激核糖体生物合成和蛋白质合成[20]。研究表明，抑制Rictor表达后，小鼠表现出胎盘缺陷和胚胎致死率增加[21-22]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠卵巢Rictor、mTORC2 mRNA及蛋白水平降低；模型组、低剂量组、高剂量组、己烯雌酚组Rictor、mTORC2 mRNA和蛋白表达水平依次升高(P<0.05)。这说明石窑当归提取物能促进Rictor、mTORC2 mRNA和蛋白表达，激活Rictor/mTORC2信号通路。

综上所述，石窑当归提取物能改善卵巢早衰大鼠性激素紊乱，促进卵泡发育、成熟，高剂量的提取物效果更明显；其机制可能与石窑当归提取物能激活Rictor/mTORC2信号通路有关。