基于宏基因组学分析不同贮藏温度下生食章鱼制品的菌相变化

薛 静 戴志远* 李 科 马继民 王洪川

（1 浙江工商大学 杭州310012 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州310012 3 浙江新天久海产有限公司 浙江舟山316000）

蛸类属软体动物门（Phylum Mollusca），头足纲（Class Cephalopoda），八 腕 目（Order Octopoda），蛸科（Octopodidae），又称章鱼[1]，是高蛋白、低脂肪、 富含多种营养成分且具有一定药用价值的海产佳品。 章鱼大多以初级加工品形式进入国内外市场，附加值较低。 以章鱼预调理食品、生食章鱼制品等为代表的章鱼精加工产品， 不仅食用方法简单， 而且具有独特的食用风味和较高的食用价值，国内外市场广阔。 然而，为保证生食章鱼制品生食风味，未采用热加工处理，故而产品初始菌相复杂，耐贮藏性较差。以上问题成为了生食章鱼制品在保障市场流通以及质量安全中的巨大隐患。

目前， 国内外学者对章鱼的研究主要集中于生态习性与养殖、营养成分分析、遗传多样性、免疫机制、生物活性物质开发利用等研究方面[2-5]，对于生食水产品的研究多集中在致病菌的监测、风险评估和分析上[6-7]，而有关即食生食水产品，尤其是生食章鱼制品这一类新产品贮藏期菌相变化的研究尚未见报道。 宏基因组学作为新兴的微生物分析手段， 克服了基于培养的传统微生物检测方法的弊端，能够更全面、客观地反映样品中微生物的组成。该方法已成为研究环境微生物群落丰度、多样性变化最有效的方法之一， 广泛应用于医学[8-9]、环境[10]、农学[11]等领域，而在食品科学领域主要集中于传统发酵食品[12-14]。参考实际生活中食品的贮藏温度，选定25，15，5，-5 ℃为温度梯度开展研究。在前期研究基础上，分别研究不同贮藏温度下生食章鱼制品产品菌相变化， 确定不同温度下生食章鱼制品中的优势菌， 旨在为章鱼贮藏保鲜提供一定的参考数据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与预处理

1.1.1 样品加工 章鱼原料由浙江新天久海产有限公司提供， 用碎冰包裹并于4 h 内运送至实验室。样品加工流程如下：章鱼原料→盐滚（去泥沙、黏液）→冰水漂洗、降温→去头、嘴、内脏等废弃物→冰水降温→切段→盐渍→脱盐、 沥水→糖浸→投料（复合调味料）→拌料→装袋→入库。

其中：复合调味料以天然植物调味料，如姜、蒜、辣椒、紫苏等，以及盐、糖、味精等调味品按不同比例调配而成。

1.1.2 样品采集 上述样品于无菌条件下分装至无菌食品级包装袋中， 并分别置于25，15，5 和-5℃条件下恒温贮藏。 根据实验室前期研究结果确定取样时间分别为：初始样品（zyl）为生食章鱼制品第0 天直接留样；-5 ℃样品（ypf5）取样时间为第90 天；5 ℃贮藏中期（zq5）为第40 天，贮藏末期（mq5）为第80 天；15 ℃样品贮藏中期（zq15d）为第8 天，贮藏末期（mq15）为第16 天；25 ℃样品贮藏中期（zq25）为第3 天，贮藏末期（mq25）为第6天。

1.2 仪器设备与材料

1.2.1 仪器设备 Fresco21 微量离心机， 美国Thermo 公司；凝胶电泳仪，美国BIO-RAD 公司；Wide Mini-SubRCell GT 水平电泳槽， 美国BIORAD 公 司；Mili-Q 超纯水机Gradient 型， 美 国GRANT 公司；RC-6 Plus 高速冷冻离心机， 美国Thermo 公司；LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器， 上海申安医疗器械厂；LRH-150-S 恒温恒湿培养箱，广东省医疗器械厂。

1.2.2 试验材料 限制性内切酶，宝生物工程（大连）有限公司；Taq DNA 聚合酶，TakaRa 宝成试剂有限公司；1 000 bp Marker，TakaRa 宝成试剂有限公司； 琼脂糖凝胶（分析纯）， 西班牙进口分装；EDTA（分析纯），无锡市展望化工试剂有限公司；RNA 酶A，美国Sigma 公司；细菌基因组DNA 小量提取试剂盒， 北京庄盟国际生物基因科技有限公司；异丙醇（分析纯），国药集团化学试剂北京有限公司；溴化乙啶（分析纯），美国Sigma 公司。

1.3 细菌DNA 的提取

参考ERMA D[15]的方法，称取样品5.0 g 置于无菌锥形瓶中，加入50 mL 无菌生理盐水，37 ℃恒温摇床振摇15 min （200 r/min）。 4 层无菌纱布过滤，收集滤液，离心（1 000 r/min，6 min，4 ℃），取上清液，再次离心（8 500 r/min，5 min，4 ℃），取沉淀。使用细菌基因组DNA 小量提取试剂盒对上述步骤中的沉淀进行处理，收集溶液，于-30 ℃条件下保存。 产物首先采用紫外分光光度计进行浓度及纯度检测。 根据浓度检测结果，采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 样品的完整性（电压120 V，电泳时间20 min）。

1.4 16S rDNA V4 区的PCR 扩增及Illumina 测序

PCR 扩增引物为520F：（5-AYTGGGYDTAAAGNG-3）和802R：（5-TACN VGGGTATCTAATCC-3）。

25 μL 反应体系为：8.75 μL 灭菌超纯水，5.0 μL Q5 Reaction Buffer（5×），5.0 μL Q5 GC high Enhancer（5×），2.0 μL dNTP（2.5mmol/L），2.0 μL模板（原液），1.0 μL 引物F（10μmol/L），1.0 μL 引物R （10μmol/L），0.25 μL Q5 Polymerase （5U/μL）。

PCR 扩增反应程序：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，27 个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR 产物用2% 琼脂糖凝胶电泳检测， 并回收， 进行Illumina 双末端测序，并以扩增产物为模板进行Illumina Mi-Seq 测序文库制备。

1.5 统计与分析

1.5.1 原始双端序列的过滤和连接 采用Illumina MiSeq 平台进行测序， 参考结合ERMA D[16]、Magoc T[17]、Caporaso JG[18]等的方法，适当改动，对原始数据进行质量过滤、筛选获取有效序列。

1.5.2 优质序列的获取 运用Qiime 进行序列过滤，去除5’端引物错配碱基数>1 的序列，去除含有模糊碱基的序列； 去除含有连续相同碱基数>8的序列，去除长度≤150 bp 的序列；去除嵌合体序列，得到优质序列，用于后续分析。

1.5.3 OTU 聚类 在Qiime 软件中调用uclust 的方法对优质序列按序列相似度0.97 进行聚类，选取每个类中最长的序列为代表序列， 并对序列数据库进行比对，获得每个OTU 代表序列的分类学信息，生成不同分类水平上（门、纲、目、科、属）的物种丰度表和多样品物种分布图。

1.5.4 多样性分析 使用mothur 软件进行Alpha多样性分析（Chao 指数、Shannon 指数）。

1.5.5 聚类分析 应用软件R（pheatmap）将属水平上分类信息进行聚类并绘制热图。

2 结果与讨论

2.1 生食章鱼细菌总基因组DNA 提取结果

生食章鱼细菌总基因组DNA 的琼脂糖凝胶电泳图谱如图1 所示。由图可知，提取到的基因组DNA 均较完整，提取结果较好，但7、8 号DNA 条带较暗， 可能是检测时使用的DNA 浓度过低，但不影响后续试验的进行。

图1 样品总基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 The extracted genomic DNA of different samples

2.2 生食章鱼细菌16s rDNA V4 可变区扩增结果

以上步骤提取到的样品细菌总基因组DNA为模板， 根据试验方法中的PCR 反应体系和程序， 对细菌16S rDNA 的V4 可变区进行扩增，扩增产物的电泳检测结果如图2 所示。 根据胶图检测结果可知，8 组样品均可扩增出目的条带，可进行后续试验。

图2 样品16S rDNA V4 可变区段PCR 扩增结果电泳图谱Fig.2 Agarose gel electrophorelogram of PCR amplicons of 16S rDNA V4 region of different samples

2.3 测序基本数据处理结果

8 个样品经DNA 测序后， 共获得16S rDNA V4 区的有效序列254 716 条， 其中样品的最大序列数为71 317 条，最小序列数为27 947 条，每个样品平均序列数为31 840 条。 质控后序列长度大部分分布在220～230 之间， 优质序列占有效序列的比例平均为96.6%，达到基本分析要求，统计结果见图3。

2.4 OTU 聚类结果

OTU（Operational Taxonomic Units，操作分类单元）是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于分析， 人为给某一个分类单元设置的同一标志[19]，通常在97%的相似水平下对序列进行OTU的聚类和后续的生物信息分析。原始OTU 列表去掉丰度值小于总序列条数0.001%的OTU 后的聚类结果如表1 所示。

2.5 Alpha 多样性分析

图3 优质序列长度分布图Fig.3 Length distribution of high quality sequence

Alpha 多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性，常用的度量指数有：群落丰富度指数及群落多样性指数。Chao 指数和ACE 指数在生态学中常用来估计物种总数[20]，指数越大，说明群落丰富度越高。 而丰富度指数存在忽略富集种和稀疏种对群落多样性贡献不同的问题， 因而需要结合均匀度指数才能更客观地反映群落的多样性水平。 Shannon 指数和Simpson 指数[21]均可用来估算样品中微生物多样性，Shannon 指数越大，说明群落多样性越高。 不同贮藏温度下生食章鱼的生物多样性指数见表2。

表1 OTU 聚类结果Table 1 Statistical analysis of OTU

表2 生食章鱼制品Alpha 多样性指数表Table 2 Alpha diversity metrics of instant octopus products

由表可知，随着贮藏时间的延长，生食章鱼制品中的物种丰富度和均匀度发生着较大的变化，且不同温度下贮藏的样品之间存在着明显差异。-5 ℃组的Chao1 指数均小于初始样品组，Shannon指数差别不大，说明在-5 ℃贮藏条件下，随着贮藏时间的延长，样品中物种数量逐渐减小，多样性变化不明显。 在5 ℃贮藏条件下，随着贮藏时间的延长，样品中物种数量增多，物种丰富度逐步增加；贮藏前期，细菌迅速繁殖，物种均匀度上升，多样性变高，贮藏后期，部分细菌快速成长为优势菌，物种均匀度下降，多样性降低。15 ℃组随着贮藏时间的延长，样品中物种数量先下降后上升，但至贮藏末期，物种丰富度仍不及初始样品，随着酸性物质的不断累积，微生物的抑制作用越发强烈，物种均匀度下降，多样性明显降低。25 ℃组随着贮藏时间的延长，样品中所含物种数量直线下降，丰富度迅速减小，优势菌优势凸显，物种均匀度变差，多样性大幅下降。

2.6 基于群落结构分析

根据OTU 表的结果，可以得到各个样品内微生物在各分类水平（门、纲、目、科、属）上的物种组成比例情况， 反映样品在不同分类学水平上的群落结构。

2.6.1 样品微生物门水平组成分析 不同温度下贮藏的生食章鱼微生物于门水平上的群落分布如图4 所示。

由图可知， 初始样品组优势微生物为变形菌门（Proteobacteria，67.1%），此外还包括厚壁菌门（Firmicutes，14.13%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，8.89%）、螺旋菌门（Spirochaetae，1.69%）和放线菌门（Actinobacteria，1.31%）。 -5 ℃条件下贮藏的样品物种组成与初始样品基本相同， 但比例稍有变化。

随着贮藏时间的延长，5，15 和25 ℃温度下贮藏的生食章鱼内部菌相发生显著变化。5 ℃条件下贮藏的样品，至贮藏中期变形菌门（62.21%）仍为优势微生物，但比例有所下降，而厚壁菌门（14.13%）、拟杆菌门（16.39%）和放线菌门（14.10%）比例均有所上升；随着贮藏时间的延长，厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门的比例明显增大， 变形菌门的比例明显下降，至贮藏末期厚壁菌门（40.15%）已迅速成长为优势微生物。15 ℃条件下贮藏的样品与25℃样品类似，随着贮藏时间的延长，变形菌门的比例急剧下降， 至贮藏中期厚壁菌门已迅速成长为优势微生物，至贮藏末期，厚壁菌门的比例已分别达到92.29%和84.81%。

2.6.2 样品微生物属水平组成分析 为了进一步分析贮藏温度对生食章鱼微生物的影响， 深入地分析不同贮藏温度下生食章鱼微生物在属水平上的组成和数量的变化情况， 如图5 所示。 由图可知， 初始样品组的优势微生物为肠杆菌属（Enterobacter，31.30%）、假单胞菌属（Pseudomonas，17.0%）。

-5 ℃条件下贮藏的生食章鱼在属水平上的组成与初始样品组基本相同，仅各属比例稍有变化，其中革兰氏阴性菌占优势。 优势微生物仍为肠杆菌属（Enterobacter，31.37%）， 此外， 假单胞菌属（Pseudomonas）和脱硫叶菌属（Desulfobulbus）比例有所下降，而明串珠菌属（Leuconostoc）、动性微菌属（Planomicrobium）、魏斯氏菌属（Weissella）和不动杆菌属（Acinetobacter）比例均有所上升。肠杆菌广泛分布在新鲜或者加工过的水产品中， 而假单胞菌属为嗜冷菌种，一般在-15～20 ℃之间最适宜生长，广泛存在于海水、淡水和土壤中，是水产品低温贮藏过程中的主要腐败菌之一。 在该贮藏条件下，样品中的产酸菌不仅比例较低，数量也较其它温度少。 假单胞菌属是一种常见的水产品腐败菌，会产生挥发性物质，比如醛、酮、酯和硫化物，会散发出特有的浓郁氨臭味[22-23]。

图4 各样本于门水平上的菌群分布Fig.4 Microflora distribution of different samples at phylum level

5，15 和25 ℃条件下贮藏的生食章鱼在属水平上的组成发生着显著变化。 5 ℃条件下，革兰氏阴性菌的优势地位下降， 样品中的葡萄球菌属在经过一段时间的缓慢增加后， 自中期开始迅速成长为优势微生物，至末期达到33.24%；贮藏期内，黄杆菌属呈直线上升趋势；假单胞菌属、脱硫叶菌属呈先缓慢上升后迅速下降的趋势；肠杆菌属、明串珠菌属和魏斯氏菌属呈直线下降趋势。 15 ℃条件下，革兰氏阳性菌占绝对优势，样品中的葡萄球菌属呈直线上升趋势， 于贮藏中期即成长为优势微生物，至贮藏末期达到81.22%；此外，贮藏期内魏斯氏菌属呈现缓慢下降后快速上升趋势， 至贮藏后期达到10.18%；肠杆菌属、假单胞菌属、明串珠菌属和脱硫叶菌属的比例呈直线下降趋势。 葡萄球菌属为革兰氏阳性菌，多数为非致病菌，广泛存在于环境中，能够产生硝酸盐还原酶，降解氨基酸和脂肪酸，并具有过氧化氢活性，多数能分解葡萄糖、麦芽糖和蔗糖产酸。

25 ℃条件下，革兰氏阳性菌占绝对优势，样品中的魏斯氏菌属于贮藏中期即迅速成长为优势微生物，并于贮藏末期达到73.58%；此外，随着贮藏时间的延长，葡萄球菌属的比例持续增加，至贮藏末期达到10.08%；肠杆菌属、假单胞菌属、明串珠菌属和脱硫叶菌属的比例呈直线下降趋势。

图5 各样本在属水平上菌群分布Fig.5 Microflora distribution of different samples at genus level

魏斯氏菌属于乳酸细菌（LAB），为革兰氏阳性菌，可代谢葡萄糖产生乳酸、二氧化碳、乙醇或（和）乙酸，最适生长温度为15～45 ℃，其生存环境比较广泛，植物型材料、肉类制品以及人和动物的粪便中均可分离得到[24-26]。 研究表明，乳酸菌可以通过抑制生长和产生抑菌代谢产物方式来阻遏其它菌的生长， 这类代谢产物包括有机酸， 细菌素等。 普通细菌的生长最适pH 值在6～7 之间，若低于该值， 细菌的生长速率将大大降低或不生长甚至死亡。

2.6.3 聚类分析 将不同温度贮藏的生食章鱼样品微生物在属水平上的分类信息进行聚类分析，结果如图6 所示。由聚类分析的结果可知：25 ℃中期样品、5 ℃末期样品、25 ℃末期样品和15 ℃末期样品4 个样品聚为一类，-5 ℃样品、 初始样品、15℃中期样品3 个样品聚为一类，5 ℃中期样品聚为一类。随着贮藏温度的升高和贮藏时间的延长，初期、 中期和末期微生物种群和数量发生了明显的变化； 降低贮藏温度对于保持生食章鱼的初始菌相具有较好的作用。

图6 样品聚类分析Fig.6 Cluster pedigree diagram of samples

3 结论与展望

本文结合宏基因组学， 利用高通量测序技术对不同贮藏温度下的生食章鱼制品贮藏期内的菌相变化进行了分析。 主要结论如下：（1）随着贮藏温度的升高和贮藏时间的延长， 菌相越发趋于单一，与初始样品差别越大，样品中的优势菌由革兰氏阴性菌逐渐转变为革兰氏阳性菌；（2）不同温度贮藏下的生食章鱼在门水平上的群落分布主要为变形菌门，厚壁菌门和拟杆菌门，随着贮藏温度的升高和贮藏时间的延长， 变形菌门的比例逐渐下降，厚壁菌门的比例逐渐上升；（3）25，15，5 ℃条件下贮藏的生食章鱼的优势菌分别为魏斯氏菌属，葡萄球菌属，葡萄球菌属；-5 ℃条件下贮藏的样品至贮藏期 （90 d）末与初始样品菌相之间差异不大，优势菌仍为肠杆菌属。 （4）降低贮藏温度对于保持生食章鱼的初始菌相具有较好的作用， 于-5℃条件下贮藏可延缓产品腐败变质，延长货架期。

本研究深入分析了生食章鱼制品贮藏期间的菌相变化，确立了不同贮藏温度下的优势菌种类，为今后进一步优化该类产品加工工艺和贮藏方法， 建立相关产品的质量安全控制体系等提供了一定的参考依据。