罗非鱼肠道乳酸菌对抗生素的药敏性

郭凤茹 刘元雪 施文正 宁喜斌 李晓晖*（ 上海海洋大学食品学院 上海20306 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心 上海20306 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海）上海20306）

乳酸菌是一类能利用碳水化合物发酵产生大量乳酸的革兰氏染色阳性的细菌。 目前报道的产乳酸细菌包括乳杆菌属、片球菌属、肠球菌属、乳球菌属等43 个属[1]。乳酸菌最早分离自酸牛乳中[2]，其后在发酵肉制品、乳制品、泡菜、发酵谷物等产品中得到广泛的研究和利用[3-6]。 乳酸菌在食品领域中的应用主要有两个方面：一是发酵微生物，在发酵制作乳制品、肉制品、泡菜的过程中起着关键的作用，另一方面是作为益生菌，定植于动物肠道中，发挥调节肠道菌群，增强免疫，抑制肠道内特异性病原菌的生长繁殖及毒素的产生等益生功能[7-8]。乳酸菌作为鱼类肠道的益生菌，在其养殖过程中也发挥重要作用。 乳酸菌可以调节鱼类肠道菌群平衡，提高饲料的营养转化率，加速鱼类生长。

随着抗生素的广泛使用， 越来越多的细菌出现耐药性，且耐药水平也不断提高，抗生素耐药性已经成为一个全球化问题[9]。 20 世纪80年代国外学者研究了乳酸菌的药敏性[10-11]，发现它们对抗生素有耐药现象。长期以来，国内外科研人员主要集中于临床致病菌的耐药性研究， 而对非致病菌和益生菌耐药性的研究报道较少[12]。 乳酸菌作为一种益生菌，它的耐药性有积极的意义。当人或动物服用抗生素时， 往往会把肠道中有益和有害的细菌同时杀灭，引起腹泻，如果乳酸菌对抗生素有抗性，就可以缓解这种不良反应，帮助宿主恢复肠道菌群平衡[13-14]。然而，有研究表明，在体外培养条件下耐药基因能在不同种属的乳酸菌菌株中发生转移[15]。 这说明对于进入人体和动物的外源性活菌在肠道内生长、定植、繁殖，其耐药基因能以各种方式在肠道菌群间相互传递， 从而导致致病菌获得耐药性，危害宿主健康[16]。

本研究采用纸片扩散法对分离自罗非鱼肠道的乳酸菌对13 种抗生素（青霉素、氨苄西林、红霉素、 卡那霉素、链霉素、庆大霉素、四环素、多西环素、万古霉素、氯霉素、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星）的药敏性进行检测和分析，为分离得到的乳酸菌应用于生产实践及水产养殖中抗生素的合理使用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供试菌株为本实验室保存的分离自罗非鱼肠道的乳酸菌，共42 株乳酸菌。 其中乳杆菌属（Lactobacillus）32 株，乳球菌属（Lactococcus）5 株，肠球菌属（Enterococcus）5 株，菌株的分离鉴定结果可参考另一篇文章[17]。 如表1 所示，采用大肠杆菌（E. coli）ATCC 35218 和金黄色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 25923 作为质控菌株。

1.1.2 试剂与培养基 含实验抗生素的13 种药敏纸片，分别为青霉素（Penicillin，PEN）、氨苄西林（Ampicillin，AMP）、 红霉素（Erythromycin，ERY）、卡那霉素 （Kanamycin，KAN）、 链霉素（Streptomycin，STR）、庆大霉素（Gentamicin，GEN）、四环素（Tetracycline，TET）、 多西环素（Doxycycline，DOX）、 万古霉素 （Vancomycin，VAN）、 氯霉素（Chloramphenicol，CHL）、环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、 诺氟沙星 （Norfloxacin，NOR）、 氧氟沙星（Ofloxacin，OFL），购于杭州微生物试剂有限公司。纸片直径为6 mm，符合抗生素纸片标准。 MRS 培养基、TPY 培养基、M17 培养基、TSA 培养基购于青岛海博生物技术有限公司。

表1 供试菌株16S rRNA 序列鉴定结果Table 1 Species identification of the test strains by 16S rRNA sequence analysis

1.2 方法

将乳杆菌属、乳球菌属和肠球菌属供试菌株分别采用相应的MRS、TPY、M17 液体培养基活化。 经转接后培养，每隔1 h 取样测定，使得到菌液的浓度为（3.0×108～8.0×108）CFU/mL。在9 cm 培养皿中分别倒入10 mL MRS、TPY、M17 琼脂培养基， 取200 μL 活化菌液与5 mL 45 ℃0.6%的相应软琼脂混匀 （此时菌液的浓度保持在1.5×107CFU/mL～3.0×107CFU/mL）， 将软琼脂均匀地铺在预先制备好的同种固体培养基上， 于室温下放置大约15 min，待上层琼脂冷却凝固后，将含有抗生素的药敏纸片通过无菌操作贴放在琼脂表面，每种药敏纸片3 个平行，4 ℃扩散3 h 后于37 ℃培养24 h，用游标卡尺测量产生的抑菌圈直径，取3次测量的平均值作为结果。 质控菌株大肠杆菌ATCC 35218 和金黄色葡萄球菌ATCC25923 的培养和保藏分别用营养肉汤和TSB 培养基， 用与上相同的方法测定。 依照CHARTERIS W P[18]对乳杆菌和乳球菌[19]的抗生素药敏标准（表2），判断乳酸菌对常用抗生素的药物敏感性。

2 结果与分析

2.1 质控菌株对抗生素的药敏实验结果

质控菌株大肠杆菌（ATCC 35218）和金黄色葡萄球菌（ATCC25923）的耐药性实验结果如图1所示，抑菌圈直径如表3 所示。 由图1 可知，质控菌株在药敏纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，近乎圆形，可用于直径的测量。 表3 的结果显示，质控菌株对实验抗生素的抑菌圈直径均在允许范围内（敏感），说明本试验方法可行，且药敏纸片有效，可进行乳酸菌对实验抗生素的药物敏感性研究。

图1 大肠杆菌对部分抗生素的药敏实验Fig.1 The susceptibility experiment of E.coli to some antibiotics

表2 抗生素抗性的判断标准Table 2 Standards for judgment antibiotic resistance

表3 质控菌株的耐药性Table 3 Antibiotic resistance of reference strain

2.2 待测菌株对实验抗生素的药敏实验结果

2.2.1 乳杆菌属乳酸菌 由表4 可知， 两种乳杆菌主要对KAN、GEN、VAN、CIP、NOR、OFL 表现出耐药性，其中对KAN、VAN、CIP 和NOR 的耐药性最强，高达80%以上；两种乳杆菌均表现多重耐药性，但对四环素类抗生素敏感。戊糖乳杆菌的3 株菌 对PEN、KAN、GEN、VAN、CIP、NOR的耐药菌株数达100%，而这些抗生素均为养殖生产中常用的抗生素种类，因此，这3 株菌有望应用于鱼类的生产，但其是否含有耐药基因以及相关的转座子，能否转移给肠道其它菌群，进而影响肠道健康，还需做基因的分型研究。植物乳杆菌的29 株菌对抗生素的耐药性种内差异较大，这可能和采样时间、采样时菌株所处环境、温度和食性等有关；但50%以上的菌株为KAN-GEN-VAN-CIP-NOR-OFL多重耐药，对抗生素敏感的菌株占比较小。

表4 乳杆菌属乳酸菌对抗生素的抗性Table 4 Antibiotic resistant patterns of the Lactobacillus

2.2.2 乳球菌属乳酸菌 由表5 可知， 棉籽糖乳球菌的药敏性遗传稳定，5 株菌之间的药敏性有一定的差异，其中对PEN（80%）和STR（60%）耐药， 对其它抗生素较敏感， 对VAN、CIP、NOR 和OFL 的敏感性达100%。

表5 乳球菌属乳酸菌对抗生素的抗性Table 5 Antibiotic resistant patterns of the Lactococcus

2.2.3 肠球菌属乳酸菌 表6 表明肠球菌属乳酸菌对实验抗生素的耐药性种间差异明显， 但对PEN、AMP、VAN、CIP、OFL 敏感，敏感菌株数分别达80%，100%，80%，80%和80%； 对ERY 中度敏感；而对其余抗生素则大多表现耐药。意大利肠球菌的2 株菌对AMP、ERY、GEN 均耐药，对TET 敏感，但对其余抗生素的药敏性不同，但本试验仅分离2 株菌，其结果不具代表性，不能说明意大利肠球菌对抗生素药敏性的平均水平。 铅黄肠球菌对PEN、AMP、CIP、VAN 和OFL 敏感（100%），对ERY中度敏感（100%），对其它抗生素耐药，菌株耐药性的差异可能来自于菌株本身生理特征和耐药基因的差异。

表6 肠球菌属乳酸菌对抗生素的抗性Table 6 Antibiotic resistant patterns of the Enterococcus

3 讨论

本研究中， 菌株LPN05 对13 种抗生素都有抗性， 是耐药普最广的菌株， 其次是LPN04、LPN01 对11种抗生素都有抗性，LPN02、LPN03对10 种抗生素有抗性。 由表7 统计结果显示，42株乳酸菌主要对PEN、KAN、GEN、VAN、CIP、NOR和OFL 耐药， 耐药菌株数分别为19 （45.2%），31（73.8%），24（57.1%），34（81.0%），30（71.4%），34（81.0%）和20（47.6%）。 罗非鱼肠道乳酸菌对13种常见抗生素的药物敏感性测试以及不同属乳酸菌对抗生素的耐药分析结果表明， 不同属乳酸菌对抗生素的耐药性表现出较明显的种间差异，而相同属的乳酸菌有其遗传耐药性， 也存在不同程度的种内差异。 不同属乳酸菌的耐药谱呈现较大不同：乳球菌属主要表现对氨基糖苷类的耐药性；肠球菌属对氨基糖肽类和氟喹诺酮类耐药； 而乳杆菌属对氨基糖苷类、糖肽类和氟喹诺酮类耐药，对四环素类抗生素敏感。 乳酸杆菌对抑制蛋白质合成的抗生素敏感，如四环素类抗生素[20-21]，与本试验结果一致。而大多数乳酸杆菌对VAN 具有高水平的抗性[22]。Hamilton-Miller 等[23]报道了嗜酸乳杆菌和德氏乳杆菌对VAN 有天然抗性，与本试验乳杆菌对VAN 的耐药性一致， 乳酸杆菌对VAN的抗性是由于它们在肽聚糖中具有D-Al-D-Lactate 而不是D-Ala-DAla 二肽[24]。而Franz 等[25]发现分离自发酵乳中的肠球菌属（主要是粪肠球菌和屎肠球菌）对VAN 敏感；而本试验中肠球菌属对VAN 耐药株为50%， 主要对AMP 敏感， 这与Lopes 等[26]的研究结果一致。 大多数乳球菌对氨基糖苷类抗生素具有抗性[27]，而本试验中乳球菌只对GEN 表现出了较高的耐药性。 这表明，乳酸菌对抗生素的耐药性可能和来源密切相关， 例如取样环境、培养条件[28-29]等都会影响敏感性测定的结果。

表7 乳酸菌对13 种抗生素的抗性统计Table 7 Data of susceptibility to 13 kinds of antibiotics of lactic acid bacteria

本研究采用分离自罗非鱼肠道的42 株乳酸菌（分别属于5 个菌种）作为供试菌株，测试它们对13 种抗生素的药敏性。 研究结果表明42 株乳酸菌都有一定的耐药性，主要对PEN、KAN、GEN、VAN、CIP、NOR 和OFL 耐药， 耐药菌株数分别为19（45.2%），31（73.8%），24（57.1%），34（81.0%），30（71.4%），34（81.0%）和20（47.6%），菌株的耐药性有一定的种间和种内差异， 部分菌株有多重耐药性。 本试验结果反映了罗非鱼肠道乳酸菌的耐药性情况， 为鱼类肠道乳酸菌应用于生产实践以及水产养殖中抗生素的合理使用提供理论基础和参考依据。