GC-MS-AMDIS结合保留指数初探内源酶对西兰花挥发性成分的影响

张 旋 白 冰 程顺昌 罗 枫 纪淑娟

（沈阳农业大学食品学院 沈阳110866）

西兰花（Brassica oleracea）又名青花菜、青花椰菜等， 属十字花科芸苔属甘蓝种中以绿花球为产品的一个变种，为一、二年生草本植物。 食用部分花球由幼嫩的小花梗和无数的小花蕾组成，富含维生素C、蛋白质、脂肪、矿物质、胡萝卜素和膳食纤维等营养素，同时还含有多酚类、黄酮类等抗氧化活性物质和硫代葡萄糖苷及其衍生物萝卜硫素等抗癌活性成分，一直备受消费者青睐[1-2]。

挥发性成分是果蔬特性中与健康和营养最密切的品质之一，也是构成和影响果蔬食用、加工质量的主要因素[3-4]。 近年来顶空固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）联用技术为挥发性成分研究提供了更环保、 更简便和准确的方法[5-13]。 自动质谱退卷积定性系统（automated mass spectral deconvolution and identification system，AMDIS）是一个处理分析GCMS 数据的优秀软件，是由美国国家标准和技术院开发，通过将GC-MS 数据文件中所有离子碎片丰度数据进行退卷积（Deconvolution）处理，推定共流出中离子碎片的归属，提取出每个成分的“干净”质谱图和相关色谱信息，对低浓度物质的峰、背景较复杂的峰和重叠峰有较强的分辨解析能力。AMDIS 结合保留指数（retention index，RI）定性更加准确，现已广泛应用在农残、环境、毒物分析等领域[14-19]，在西兰花挥发性成分研究方面尚未见报道。

果蔬中挥发性成分多而复杂，既受品种、栽培条件、采后处理等因素的影响，又与贮藏过程中生理生化变化密切相关[20]。 同时，部分果蔬组织细胞被破坏时， 其所含的非挥发性前体物质在酶的催化下形成新的挥发性成分，例如大蒜、洋葱等[21]。大量研究表明果蔬中挥发性物质的产生都是以营养物质为基础，通过不同的生物酶而逐渐演化的，然而尚有很多重要的挥发性香气的代谢途径未能解释清楚[22]。 目前关于西兰花挥发性成分的研究多集中在品种[23-24]、贮藏条件影响[25-28]等方面，关于其形成与代谢途径等研究尚未见报道。 本研究根据西兰花样品处理方式不同与挥发性成分形成的差异，初步探讨内源酶对挥发性物质形成的影响，为进一步探明西兰花主要挥发性成分的形成与转化机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验用西兰花分两批次购于市场，花蕾紧实、花球大小相同，每组试验3 次重复。 C6～C44 正构烷烃混标，上海源叶生物科技有限公司。

7890A-5975C GC-MS 联用仪，安捷伦科技有限公司；NW-10VF 超纯水系统， 上海康雷分析仪器有限公司； 固相微萃取手柄，65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS 萃取头，美国Supelco 公司。

1.2 方法

剪切西兰花为末端2～6 mm 的小花蕾， 准确称量3.00 g 装入15 mL 顶空瓶，50 ℃恒温水浴中萃取40 min，GC-MS 进样250 ℃解吸5 min，作为①剪切组。同时比较②常温研磨③低温研磨（加液氮）④灭酶研磨（沸水浴10 min）样品处理方式下挥发性成分差异。

1.3 GC-MS 检测条件[25-28]

HP-5MS 色谱柱，载气为99.999%氦气，流速1 mL/min，进样口温度为250 ℃，分流进样，分流比1∶30，程序升温40 ℃保持3 min，以5 ℃/min 升至120 ℃，再以10 ℃/min 升至220 ℃保持10 min。

接口温度280 ℃，电子电离（electron ionization EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，质量扫描范围m/z 30～450。

1.4 数据分析

经7890A-5975C 数据分析系统中AMDIS 进行自动解卷积（最低匹配因子设为80）处理，通常是从AMDIS 自带的环境、香精香料等质谱库中按照正逆匹配度高低，得到可能性物质，但由于这些质谱库中化合物有限，因此本研究采用AMDIS 处理后，通过NIST11 质谱库检索，选取正逆匹配度均在800（最高值为1 000）以上的可能物质，测定并计算RI 值， 然后与NIST11 质谱库或文献[18，32]中RI 进行比较定性（相对误差<±3%）。RI 计算公式如下：

式中：RI——程序升温保留指数；n——正构烷烃的碳原子数；tRn+1和tRn分别为碳数为n、n＋1的正构烷烃的保留时间/min；tRx——被测组分保留时间/min，且tRn+1＞tRx＞tRn。

此外， 由于每次试验中萃取西兰花挥发性物质的数量、 种类不同， 本研究在取样量相同情况下，以峰面积表示吸附量，进行含量比较。

2 结果与分析

2.1 SPME 纤维头的选择

果蔬中的香气成分较复杂， 同时细胞破裂也引入了酶的参与， 从而导致一系列化学及生化变化[28]，为了减少干扰，纤维头的选择试验使用的是西兰花小花蕾， 即样品处理方式为剪切。 65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 和100 μm PDMS纤维头是香味物质分析常用的萃取头[29-31]，3 种纤维头吸附西兰花挥发性成分的总离子流图见图1。 总离子流图显示，65 μm PDMS/DVB 较其它2种纤维头出峰的数量和种类多。 通过AMDIS 分析、NIST11 谱库检索及保留指数计算， 西兰花挥发性成分鉴定结果如表1 所示，共鉴定出26 种挥发性成分，其中甲硫醇、二甲基硫、二甲基二硫、异戊醇、顺-3-己烯醇、乙酸叶醇酯、柠檬烯及正戊酸-（Z）-3-己烯酯是文献报道的共有物质[23-25，27，31]。

除去甲基硅氧烷，65 μm PDMS/DVB 萃取到西兰花挥发性成分16 种，分别是链长C1～C5低沸点、 小分子质量化合物4 种，C6～C12沸点较低、分子质量较小化合物10 种，C12以上沸点较高、分子质量较大化合物2 种；75 μm CAR/PDMS 萃取到11 种，分别为链长C1～C5低沸点、小分子质量化合物7 种，C6～C12沸点较低、 分子质量较小化合物4种；100 μm PDMS 仅萃取到链长C1～C5低沸点、小分子质量化合物4 种。 结果显示75 μm CAR/PDMS 对西兰花挥发性成分中C1～C5低沸点、小分子质量化合物吸附更灵敏， 而65 μm PDMS/DVB更适合宽沸程化合物萃取， 且含文献报道的共有物质最多， 因此该纤维头更适合于西兰花挥发性成分的分析测定。

图1 不同纤维头萃取西兰花挥发成分的总离子流图Fig.1 Totalion current chromatogram of volatile components in broccoli by different SPME fibers

表1 不同纤维头萃取西兰花挥发性成分鉴定结果Table 1 Volatile compounds of broccoli by different SPME fibers

（续表1）

2.2 样品处理

剪切、常温研磨、液氮研磨及灭酶研磨4 种样品处理方式萃取的西兰花挥发性成分总离子流图及分析结果如图2、表2 所示。 4 种样品处理方式分别鉴定出了23，25，22，8 种挥发性成分，其中剪切组中酯类含量占检出成分的42.11%， 醇类占41.22%，甲基硅氧烷占8.82%，硫化物占3.53%，烯烷类等其它占4.32%；常温研磨中醇类占51.48%，硫化物占27.71%，酯类占16.19%，甲基硅氧烷占3.21%，醛类占0.93%，呋喃等其它占0.48%；液氮研磨处理中醛类占79.81%，醇类占3.5%，硫化物占3.44%，甲基硅氧烷占7.04%，酮类3.06%，酯类占1.42%，呋喃等其它占1.73%；灭酶研磨处理中醛类占19.91%，呋喃6.96%，甲基硅氧烷占72%，烃烷类占1.13%。

图2 不同样品处理方式的西兰花挥发成分总离子流图Fig.2 Totalion current chromatogram of volatile components in broccoli by different sample preparation

表2 不同样品处理方式下西兰花挥发性成分分析结果Table 2 Volatile compounds of broccoli by different sample preparation methods

（续表2）

挥发性硫化物及己烯醛、己烯醇等脂肪醛、脂肪醇都是构成十字花科蔬菜特征香气的重要组分。除了4 种甲基硅氧烷，剪切组和常温研磨检出硫化物、顺-3-己烯-1-醇、正己醇、乙酸叶醇酯等12 种共有物质，其中甲硫醇、乙酸叶醇酯的含量，处理间并无显著差异；二甲基硫、二甲基二硫及二甲基三硫的含量，处理间均有极显著差异（P<0.01），即常温研磨中的二甲基硫/三硫显著高于剪切组（二甲基三硫未检出），而二甲基硫含量相反。由于常温研磨中西兰花组织细胞完全破裂， 内源酶能充分发挥作用， 因此该结果显示西兰花挥发成分中的二甲基硫/三硫是酶催化产物，通常是谷胱甘肽及半胱氨酸衍生物在γ-谷氨酰转肽酶、氧化酶、 裂解酶的共同作用下产生二硫或三硫[33]；顺-3-己烯-1-醇、正己醇含量，常温研磨显著高于剪切组（P<0.01），同时常温研磨还含有己醛和2-己烯醛，而剪切组未检测到醛类。

常温研磨和低温研磨组检出硫化物、1-戊烯-3-醇、正己醇、己醛、2-己烯醛、2-乙基呋喃、萘等9 种共有物质（甲基硅氧烷除外）， 但含量差异较大。由于液氮抑制了酶的作用，因此低温研磨组中二甲基二硫/三硫的含量低于常温研磨组，差异极显著（P<0.01），该结果符合上述二甲基硫/三硫是酶催化产物结论；低温研磨组中己醛和2-己烯醛的含量极显著高于常温研磨（P<0.01），而顺-2-己烯-1-醇、 顺-3-己烯-1-醇含量极显著低于常温研磨组（P<0.01），酯类含量和种类都低于常温研磨组， 特别是未检出特征挥发性成分之一的乙酸叶醇酯。

沸水浴10 min 使酶失活或钝化， 在4 种样品处理方式中是酶活最弱的一组。 失去了酶的催化，西兰花组织细胞所含的非挥发性前体物质无法形成挥发性物质， 同时沸水浴过程中一些极性物质挥发或溶于水而损失较大， 因此灭酶研磨组只检测到了2-乙基呋喃、己醛、壬醛和4 种甲基硅氧烷。

3 讨论

4 种样品处理方式的重要区别在于组织细胞破裂及酶被释放程度， 剪切仅使嫩茎断面处细胞破裂， 酶不能像常温研磨那样充分作用于某些挥发性成分的前体物质； 低温研磨组优点在于液氮的挥发隔绝了氧，并且低温又抑制了酶解；加热同样是使酶失活， 因此4 种样品处理方式得到的西兰花挥发性成分差别很大。醛类含量，低温研磨极显著高于其它3 组（P<0.01）；醇类、酯类含量，常温研磨＞剪切组＞低温研磨＞灭酶研磨 （均P<0.01）；二甲基硫含量，剪切组＞常温研磨＞低温研磨=灭酶研磨；二甲基二硫/三硫含量，常温研磨＞低温研磨＞剪切组＞灭酶研磨。

挥发物质属于果蔬的次级代谢产物， 通过不同的生物酶逐渐演化， 尚有很多重要的挥发性香气的代谢途径还没有完全解释清楚， 已知的合成途径分为脂肪酸合成途径、 氨基酸合成途径和萜类合成途径。 前期研究已表明亚麻酸是西兰花脂肪酸主要成分，采样当天占总脂肪酸的78%，其次是亚油酸，占10%[34]。 果蔬中含有的亚油酸或亚麻酸，在脂氧合酶（LOX）作用下形成氢过氧化物，进而在过氧化物裂解酶作用下分解生成醛类化合物或羟基羧酸类化合物， 醛类化合物在醇脱氢酶作用下可以进一步转化成醇类化合物[21-22]，因此说明试验结果中（E）-2-己烯醛、顺-3-己烯-1-醇、顺-2-己烯-1-醇及己醛、正己醇是以亚麻酸和亚油酸为前体物质LOX 合成途径的主要产物，进而合成了乙酸叶醇酯等相应酯；根据低温研磨结果，可以推测液氮对LOX 酶及过氧化物裂解酶的活性没有抑制， 产生了大量醛类， 但醇脱氢酶受到了抑制，从而减少正己醇、顺-3-己烯-1-醇等醇类化合物产生，导致酯类底物来源的短缺，造成酯类含量的减少；剪切组未检出醛类，可能是量少自然挥发损失了。此外，作为西兰花中重要的挥发性成分之一的硫化物，分别检出甲硫醇、二甲基硫、二甲基二硫和三硫，和已有报道相符[21，23-25，27，31]。 含硫氨基酸（sulfur-containing amino acids）和硫甲基蛋氨酸（S-methylmethionine，SMM）是蔬菜中挥发性硫化合物的重要前体物质， 通过自然分解和酶解等代谢途径产生挥发性硫化合物[35]。 本研究结果说明西兰花中二甲基二硫/三硫主要是通过酶催化作用产生的， 二甲基硫是前体物质自然分解还是细胞衰老降解而产生，以及二甲基二硫/三硫的形成机制还有待深入研究。

图3 空白试验的总离子流图Fig.3 Totalion current chromatogram of the blank test

值得注意的是试验结果中的六甲基环三硅氧烷（Hexamethylcyclotrisiloxane，D3）、八甲基环四硅氧烷（Octamethylcyclotetrasiloxane，D4）、十甲基环五硅氧烷（Decamethylcyclopentasiloxane，D5）及十二甲基环六硅氧烷（Dodecamethylcyclohexasiloxane，D6）4 种挥发性甲基硅氧烷，均有稳定的保留时间，峰型较好且不受背景干扰，使用谱库检索就能很好定性。 由于SPME 纤维头的涂层含有聚二甲基硅氧烷，故进行了空白试验，其总离子流图及峰面积见图3，检测到D3、D4、D5，未检出D6，但通过与样品中的峰面积（例如表2）相比较，发现样品中的D3、D4、D5 含量极显著高于空白试验（P<0.01），猜测样品中的D3、D4、D5 及D6 主要来源于西兰花自身。 空白试验中的甲基硅氧烷是纤维头固定相流失造成，还是来源于空气[36]，还有待于进一步研究。 挥发性甲基硅氧烷是被广泛添加于工业用品及个人护理品中的有机硅制品的基本原料，由于化学性质稳定，进入环境后表现出持久性及生物富集性，已有报道空气中监测到D3、D4、D5 及D6[36-37]。 因此，西兰花挥发性成分含有挥发性甲基硅氧烷尚需进一步研究。