含邻苯二酚结构的植物多酚对脂肪氧合酶的抑制作用

赵谋明 焦 铭 林恋竹 欧蓉蓉

（华南理工大学食品科学与工程学院 广州510640）

脂肪氧合酶（LOX）是一种氧化还原酶，在动植物中广泛存在。 植物源LOX 和动物源LOX 具有较高的氨基酸序列同源性。 具有十八碳结构的不饱和脂肪酸（例如亚油酸）是植物源LOX 的主要底物[1-3]。 目前我国大豆分离蛋白的生产能力已居全球首位， 然而， 脱脂豆粕中存在较高活性的LOX，在脱脂豆粕储存过程中，LOX 能催化残留的亚油酸缓慢发生脂质过氧化反应， 进而导致大豆蛋白氧化，从而降低其热稳定性、凝胶强度和持水性[4-6]。 探寻有效干预LOX 催化亚油酸诱导大豆蛋白氧化的方法， 对于大豆制品品质控制与提升十分重要。 植物多酚广泛分布于蔬菜、水果、香辛料以及谷物中， 是植物体内最重要的次生代谢产物之一[7]。 据报道，具有邻苯二酚结构单元的植物多酚，如槲皮素，具有很强的抗氧化以及与蛋白质结合的能力[8]。 采用植物多酚抑制LOX 活性，干预LOX 催化亚油酸诱导大豆蛋白氧化， 是切实有效的途径[9-11]。 然而，目前鲜有关于植物多酚对LOX抑制作用机制的研究。

本文采用亚油酸-脂肪氧合酶（LOX）体系，研究4 种含邻苯二酚结构的植物多酚（咖啡酸、绿原酸、儿茶素和槲皮素）对LOX 的抑制作用，基于Linweaver-Burk 作图法及荧光光谱法明晰其作用机制，为通过调控LOX 活性来干预大豆蛋白氧化提供理论与方法的指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 仪器与设备

AL204 分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；酶标仪，美国Thermo 公司；LUMINA 荧光分光光度计，美国Thermo 公司。

1.3 方法

1.3.1 植物多酚对LOX 的抑制活性测定[12]分别配制1.5 mmol/L 咖啡酸、绿原酸、儿茶素、槲皮素乙醇溶液，使用前用硼酸缓冲液（0.2 mol/L，pH 9.0）稀释至不同浓度。 在96 孔紫外板中分别加入不同浓度的多酚稀释液50 μL，加入50 μL 用硼酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 9.0）稀释好的LOX 溶液（11.33 U/mL），37 ℃孵育10 min， 加入150 μL 0.107 mol/L 亚油酸启动反应，立即在234 nm 波长下开始读数，每10 s 读一次，共计5 min，将所有读数值对反应时间作图， 所绘直线斜率为LOX 活性（I多酚）。 以硼酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 9.0）代替多酚溶液，测定LOX 活性（I空白）。 试验重复3 次。多酚干预后，LOX 相对酶活的计算公式为：

IC50值为LOX 相对酶活为50%时多酚的浓度。

1.3.2 植物多酚对LOX 的抑制类型研究 采用1.3.1 节中LOX 抑制活性的测定方法，固定亚油酸浓度为0.15 mmol/L， 研究不同浓度的多酚溶液（终浓度分别为0，40，100，160，200 μmol/L）对不同浓度的LOX 溶液（质量浓度分别为0，5.66，8.50，11.33，14.16，21.24 U/mL）的抑制作用。

在此基础上，固定酶质量浓度为11.33 U/mL，研究不同浓度多酚溶液 （终浓度分别为0，40，100，160，200 μmol/L）在不同浓度的亚油酸溶液（终浓度分别 为0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mmol/L）条件下对LOX 的抑制作用， 采用Linweaver-Burk 作图法判定多酚对LOX 的抑制类型。

1.3.3 植物多酚对LOX 内源性荧光的影响[13]在比色皿中加入2 mL LOX（11.33 U/mL）溶液，分次滴加10 mmol/L 的多酚溶液，每次2 μL，使得多酚终浓度分别为0，10，20，30，40，50，60，70 μmol/L，混匀，静置5 min 后，设定激发波长为280 nm，发射波长扫描范围为290～500 nm，激发和发射狭缝宽度均为2.5 nm，整个过程保持在25 ℃条件下进行，获得荧光光谱。

1.3.4 植物多酚对LOX 构象的影响[14]在比色皿中加入2 mL LOX（11.33 U/mL）溶液，分次滴加10 mmol/L 的多酚溶液，使得多酚终浓度分别为0，5，10，20，30，40，50 μmol/L，混匀，静置5 min 后，设定激发波长扫描范围为250～330 nm，发射波长扫描波长范围为265～345 nm，激发和发射狭缝宽度均为2.5 nm， 获得Δλ=15 nm 时LOX 的同步荧光光谱； 设定激发波长扫描范围为250～310 nm，发射波长扫描波长范围为310～370 nm，激发和发射狭缝宽度均为2.5 nm， 获得Δλ=60 nm 时LOX 的同步荧光光谱。

运用GEODA1.4.6对大连市主城区房价进行局域空间自相关研究，得出莫兰指数值为0.42，z得分较高为15.0，p值较低为0，说明大连市主城区的房价在空间上布局为集聚，具有较明显的空间正相关，也就是价格高/高或低/低集聚。

1.3.5 植物多酚交互作用对LOX 活力的影响[15]采用1.3.1 节中LOX 抑制活性的测定方法，分别研究植物多酚在不同浓度下两两复合时LOX的活力，探究植物多酚交互作用对LOX 活力的影响。Va和Vb分别表示两种不同植物多酚分别作用时LOX 的活力，Vab表示植物多酚两两复合时LOX 的活力，Vc=Va×Vb。 当植物多酚两两之间存在协同作用（synergistic，SY），则Vab-Vc<-0.10；当植物多酚两两之间存在相加作用（additive，AD），则-0.100.10。

1.3.6 数据处理 采用SPSS 19.0 软件中的ANOVA 方法对数据进行差异显著性检验分析，以P<0.05 为差异显著，数据以平均值±标准差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 植物多酚对LOX 活力抑制作用

据报道， 植物多酚具有良好的LOX 抑制活性，酚羟基的数目与位置对植物多酚的LOX 抑制活性具有显著性影响[16]。 本文选取含有邻苯二酚结构的植物多酚（咖啡酸、绿原酸、儿茶素和槲皮素），研究其对LOX 抑制作用（图1）。

图1 植物多酚对LOX 活力的影响Fig.1 Effect of selected phenolics on LOX activities

研究结果表明：LOX 活力随着多酚浓度增大逐渐降低。 植物多酚浓度越高，对LOX 活力抑制作用越强，表明植物多酚对LOX 抑制活性呈剂量依赖关系。4 种多酚对LOX 活力的抑制作用，从强到弱依次为槲皮素 （IC50=127.21 μmol/L）>儿茶素（IC50=143.34 μmol/L）>咖啡酸 （IC50=165.51 μmol/L）>绿原酸（IC50=179.70 μmol/L）。

2.2 植物多酚对LOX 的抑制类型

植物多酚对LOX 活力抑制的v-[LOX]曲线如图2 所示。 结果表明：酶促反应速率（v）随酶浓度增加而逐渐增加，且随多酚浓度增加而逐渐减小。不同浓度植物多酚干预时，所绘制的v-[LOX]曲线是一簇通过原点的直线，说明咖啡酸、绿原酸、儿茶素和槲皮素对LOX 活力的抑制作用均为可逆性抑制作用[17]。

图2 植物多酚对LOX 活力抑制的v-[LOX]曲线Fig.2 Plots of velocity （v）versus [LOX] at different concentrations of phenolics

在此基础上，以酶促反应速率的倒数（1/v）对亚油酸浓度的倒数（1/[S]）做Lineweaver-Burk 双倒数曲线，如图3 所示。 不同浓度绿原酸作用下，以1/v 对1/[S]作图，得到5 条斜率不同的直线，但5 条直线无相同交点。 不同浓度咖啡酸作用时，所得双倒数曲线虽交于一点，但交点既不在1/v 轴，也不在1/[S]轴。说明绿原酸与咖啡酸为LOX 的混合型抑制剂。 不同浓度儿茶素/槲皮素作用时，所得双倒数曲线均在1/[S]轴交于一点，说明儿茶素/槲皮素浓度的增加不影响米氏常数（Km），提示儿茶素与槲皮素是LOX 的非竞争性抑制剂。Jameson等[18]研究表明：富含咖啡酸和绿原酸的绿咖啡豆经过消化吸收后是LOX 的混合抑制剂。

当多酚为LOX 的混合型抑制剂时，米氏方程可变换为：

v——酶促反应速率，vmax——最大酶促反应速率；Km——米氏常数/μmol·L-1；Ki——抑制常数/μmol·L-1；α——混合型抑制作用的变换系数；[I]——多酚浓度/μmol·L-1；[S]——LOX 浓 度/U·mL-1。

图3 植物多酚对LOX 活力抑制的Lineweaver-Burk 曲线Fig.3 Lineweaver-Burk plots for LOX inhibition types of selected phenolics

绿原酸、咖啡酸、儿茶素和槲皮素对LOX 的抑制常数Ki和变换系数α 如表1 所示。 当α=1时，多酚是LOX 的非竞争性抑制剂；当α=∞时，多酚是LOX 的竞争性抑制剂； 当0<α<1 时，多酚是LOX 的以非竞争性抑制为主导的竞争-非竞争性混合型抑制剂；当α>1 时，多酚是LOX 的以竞争性抑制为主导的竞争-非竞争性混合型抑制剂[19-20]。 如表1 所示，绿原酸与咖啡酸是LOX 的以非竞争性抑制为主导的竞争-非竞争性混合型抑制剂， 绿原酸/咖啡酸可与LOX 活性中心结合，也可与LOX 非活性中心结合， 还可与LOX-亚油酸复合物结合， 但绿原酸/咖啡酸对LOX-亚油酸复合物的亲和力强于绿原酸/咖啡酸对LOX 的亲和力。4 种多酚对LOX 的抑制常数Ki从高到低依次为：绿原酸>咖啡酸>槲皮素>儿茶素，说明儿茶素对LOX 的亲和力最强，其次为槲皮素，再次是咖啡酸，最后是绿原酸。

表1 4 种多酚对LOX 的抑制常数Ki、变换系数α、猝灭常数KSV、结合常数Ka 和结合位点数nTable 1 Inhibition constant Ki， transform coefficient α， quenching constants KSV， binding constants Ka and number of binding sites n of selected phenolics on LOX

2.3 植物多酚对LOX 内源性荧光的影响

蛋白分子中，能发射荧光的氨基酸有色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸， 尤其以色氨酸荧光强度最大，因此，常将其作为内源性荧光探针。 随多酚浓度增加，LOX 内源性荧光强度逐渐减弱（数据未显示）， 说明4 种多酚均能与LOX 结合， 导致LOX内源性的荧光猝灭。

以F0/F 对[Q]得到Stern-Volmer 曲线（数据未显示）， 曲线不呈线性且呈现弯曲向上的趋势，说明静态猝灭和动态猝灭同时存在于多酚与LOX相互作用过程中[21]。 采用改进后的Stern-Volmer方程分别研究4 种多酚与LOX 相互作用时的动态猝灭常数KSV（表1）：

式中，F0——未加入多酚时LOX 的荧光强度；F——加入多酚时LOX 的荧光强度；f——多酚对发色基团的可及分数；[Q]——多酚浓度/μmol·L-1。

采用以下方程分别研究4 种多酚与LOX 相互作用时的结合常数Ka和结合位点数n（表1）：

结果表明：4 种多酚对LOX 的猝灭常数KSV从大到小， 依次为槲皮素>儿茶素>咖啡酸>绿原酸， 说明槲皮素与儿茶素相对于咖啡酸与绿原酸更易与LOX 中色氨酸、 酪氨酸以及苯丙氨酸结合， 导致荧光猝灭。 4 种多酚与LOX 的结合常数Ka从大到小， 依次为槲皮素>儿茶素>绿原酸>咖啡酸， 说明植物多酚既可与能发射荧光的氨基酸结合，也可与不能发射荧光的氨基酸结合。 此外，多酚-LOX 相互作用可能会改变LOX 构象， 导致其内源性荧光变化[22]。 4 种多酚与LOX 的结合位点数均大于1， 说明它们可以与LOX 进行多点结合[23]。4 种多酚对LOX 活力的抑制作用，从强到弱依次为槲皮素>儿茶素>咖啡酸>绿原酸，说明多酚对LOX 的抑制活性不仅取决于多酚与LOX 的亲和力强弱，还取决于多酚与LOX 的结合位点。

2.4 植物多酚对LOX 构象的影响

Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm 所得同步荧光光谱分别表示酪氨酸、色氨酸残基的光谱特性[24]。 酪氨酸、 色氨酸残基所处微环境的亲疏水性变化可用以表征多酚对酶构象的影响。多酚干预后，LOX 在Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm 时的同步荧光光谱如图4所示。

图4 多酚对LOX 在Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm 时的同步荧光光谱的影响及对LOX 最大荧光吸收峰荧光强度的F/F0-[Q]曲线Fig.4 The synchronous fluorescence spectra of LOX and the corresponding intensity changes of the maximum emission peak plotted as F/F0-[Q] plots in the presence of （a）chlorogenic acid， （b）caffeic acid， （c）catechinic，（d）quercetin at Δλ=15 nm and Δλ=60 nm

如图4a 所示， 随着绿原酸浓度的增加，当Δλ=15 nm 时，LOX 最大吸收波长从315 nm 蓝移至305 nm， 酪氨酸残基所处微环境的极性降低，疏水性增加；当Δλ=60 nm 时，LOX 最大吸收波长从343 nm 蓝移至340 nm，色氨酸所处微环境的极性降低，疏水性增加；如图4b 所示，随着咖啡酸浓度的增加，当Δλ=15 nm 时，LOX 最大吸收波长从315 nm 蓝移至305 nm，酪氨酸残基所处微环境的极性降低，疏水性增加；当Δλ=60 nm 时，LOX 最大吸收波长从344 nm 蓝移至340 nm，色氨酸所处微环境的极性降低，疏水性增加；随着绿原酸/咖啡酸浓度的增加，Δλ=15 nm 时F/F0对[Q]所绘制的曲线斜率大于Δλ=60 nm 时， 说明绿原酸/咖啡酸与LOX 的结合位点离酪氨酸残基更近[25]；如图4c，随着儿茶素浓度的增加，当Δλ=15 nm 时，LOX最大吸收波长从315 nm 蓝移至305 nm，酪氨酸残基所处微环境的极性降低，疏水性增加；当Δλ=60 nm 时，LOX 最大吸收波长从343 nm 蓝移至340 nm，说明色氨酸所处微环境的极性降低，疏水性增加；Δλ=15 nm 时F/F0对[Q]所绘制的曲线斜率和Δλ=60 nm 时差别不大， 说明儿茶素与LOX 的结合位点与酪氨酸、色氨酸残基距离相差不大。如图4d，随着槲皮素浓度的增加，当Δλ=15 nm 时，LOX 最大吸收波长从315 nm 蓝移至305 nm，酪氨酸残基所处微环境的极性降低，疏水性增加；当Δλ=60 nm 时，LOX 最大吸收波长从343 nm 红移至350 nm， 说明色氨酸所处微环境的极性增加，疏水性随着槲皮素浓度的增加而降低；Δλ=60 nm时F/F0对[Q]所绘制的曲线斜率大于Δλ=15 nm时，说明槲皮素与LOX 的结合位点离色氨酸残基更近。

2.5 儿茶素和槲皮素的交互作用对LOX 活力的影响

本文探讨了具有强LOX 抑制活性的两种黄酮类化合物（儿茶素和槲皮素）的交互作用对LOX抑制活力的影响，结果如表2 所示。

结果表明： 低浓度的儿茶素和槲皮素两两复合时，呈现协同作用；高浓度的儿茶素和槲皮素两两复合时，呈现相加作用。 槲皮素是强LOX 抑制剂，可与LOX 非活性中心高效结合，改变LOX 分子构象，更有利于儿茶素与LOX 结合，因此低浓度时，两种黄酮呈现协同作用；儿茶素和槲皮素均可有效抑制LOX 活力， 均与LOX 的非活性中心有较强的亲和力， 可与其进行多点结合， 高浓度时， 儿茶素/槲皮素会竞争性地占据结合位点，两种黄酮呈现相加作用。

表2 儿茶素和槲皮素交互作用对LOX 活力的影响Table 2 Interactions of catechin with quercetin on LOX

3 结论

含有邻苯二酚结构的黄酮类化合物（儿茶素和槲皮素）对LOX 的抑制作用强于酚酸类化合物（绿原酸和咖啡酸）。 儿茶素与槲皮素是LOX 的非竞争型抑制剂，绿原酸与咖啡酸是LOX 的以非竞争性抑制为主导的竞争-非竞争性混合型抑制剂。多酚对LOX 的抑制活性不仅取决于多酚与LOX的亲和力强弱， 还取决于多酚与LOX 的结合位点。低浓度的儿茶素和槲皮素两两复合时，呈现协同作用，可高效调控LOX 活性来干预大豆蛋白氧化。