N-乙酰半胱氨酸对槲皮素稳定性的影响及两者联合抗肿瘤活性评价

王立峰 陈 琳 姚轶俊 李枝芳 王海鸥

（1 南京财经大学食品科学与工程学院 江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心 南京210023 2 南京晓庄学院食品科学学院 南京211171）

槲皮素从洋葱、苹果、苦荞、绿茶等食物中获得[1-4]，是最常见的膳食类黄酮之一，同时具有优异的抗肿瘤活性[5-6]，因此，把槲皮素开发成高效的天然抗肿瘤药物具有重大意义。 虽然槲皮素的抗肿瘤活性显著，但是，槲皮素的化学不稳定性和水溶性差的特点还是明显限制了槲皮素的生物利用率[7-8]。

N-乙酰半胱氨酸（NAC）具有良好的水溶性和抗氧化活性[9-10]，在食品领域有着十分广泛的应用前景。 NAC 具有还原性巯基，可以中和未成对的电子，发挥高效的抗氧化作用[11]。有研究表明NAC可作为玉米油在储藏烹饪油炸过程中的抗氧化剂，并且其抗氧化作用效果要强于BHA[12]。 NAC还可抑制果汁的褐变和有害挥发物呋喃酮、 聚乙烯乙二醇的产生[13]。此外，NAC 还可作为多种产品的稳定剂，例如：冰淇淋、调味酱、果酱、稀奶油、蛋黄酱、番茄沙司等。

本研究基于槲皮素易被氧化和NAC 具有优异抗氧化能力的特点，首先考察NAC 对槲皮素在细胞培养液中稳定性的影响， 其次评价槲皮素与NAC 对HepG-2肝癌细胞、Caco-2结肠腺癌细胞、MKN-28 胃癌细胞和MDA-MB-231 乳腺癌细胞的联合抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

槲皮素， 美国sigma 公司；N-乙酰半胱氨酸，上海碧云天生物技术公司；甲醇，德国默克公司；HepG-2 肝癌细胞、MKN-28 胃癌细胞、MDA-MB-231 乳腺癌细胞、Caco-2 结肠腺癌细胞，中国科学院细胞库；MEM 培养基、1640 培养基、DMEM 培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、青霉素-链霉素溶液，美国Gibico 公司。

1.2 仪器与设备

SpectraMax M2e 多功能酶标仪， 美国分子仪器公司；BB15 CO2培养箱，美国Thermo Fisher 公司；Agilent 1100 高效液相色谱、Agilent 1100 DAD检测器、Agilent 1100 四元泵、Agilent SBC18 分析柱（5 μm，4.6 mm × 250 mm），美国Agilent 公司；FRQ-1006TH 小型超声波清洗机， 杭州法兰特超声波科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 储备液的配制

1）槲皮素储备液的配置 准确称取槲皮素30.20 mg， 溶于1 mL 的DMSO 中，-20 ℃密封储存。

2）NAC 储备液的配置 准确称取NAC 粉末81.60 mg，溶于1 mL 的PBS 溶液中，-20 ℃密封储存。

1.3.2 槲皮素含量的测定 用高效液相色谱（HPLC）测定槲皮素在培养液中的浓度。

1）样品的制备 将槲皮素储备液用培养液稀释至50，100，150，200，250 μmol/L，或用分别含1，2，3，4，5 mmol/L NAC 的培养液将槲皮素储备液稀释至200 μmol/L，置于CO2培养箱（37 ℃）中降解，分别于0，0.5，2，4，6，8，10，12，14 h 取样，用HPLC 测定槲皮素的浓度。 培养液：DMEM 培养基+0.1%青霉素-链霉素溶液+10%胎牛血清。

2）高效液相色谱条件 A 相：超纯水，B 相：甲醇；等度洗脱：23%A+77%B （15 min）；检测波长380 nm， 进样量10 μL， 柱温30 ℃， 流速0.8 mL/min。

3）标准曲线的绘制 30.20 mg 槲皮素用甲醇分别稀释至50，100，150，200，250 μmol/L。 以槲皮素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归， 标准曲线方程为：Y=31.178X+21.02，R2=0.9906。

1.3.3 细胞增殖抑制率的测定 槲皮素和NAC用培养液配制成表1 所示的联合浓度备用，DMSO终浓度均定容到体积分数0.4%。 将HepG-2、MKN-28、MDA-MB-231 和Caco-2 细胞分别铺于96 孔板上，培养过夜后，将原培养液弃去，分别加入表1 所示的不同系列培养液200 μL，对照组为仅含0.4%的DMSO 培养液，培养24 h，将培养液弃去， 用PBS 清洗2 次。 每孔加入120 μL 的1 mg/mL 的MTT 溶液，培养4 h，弃去MTT 溶液，每孔加入100 μL DMSO，37 ℃振荡20 min，570 nm处测吸光度。HepG-2，Caco-2 细胞培养液：DMEM培养基+10%的胎牛血清+0.1%的青霉素-链霉素；NKN-28 细胞培养液：1640 培养基+10%的胎牛血清+0.1%的青霉素-链霉素；MDA-MB-231 细胞培养液：MEM 培养基+10%的胎牛血清+0.1%的青霉素-链霉素。

表1 槲皮素（Que）和NAC 的联合作用浓度Table 1 The combined treatment concentration of quercetin （Que）and NAC

细胞增殖抑制率的计算公式：

式中：A1——对照组的吸光度；A2——试验组的吸光度。

1.3.4 半数抑制浓度（IC50）和联合指数（CI）的计算 利用软件Graphpad Prism 8 拟合计算槲皮素、NAC 单独作用时的IC50（24 h）值，以及同一浓度NAC 与不同浓度槲皮素联用时， 槲皮素的IC50值。 按公式（2）计算CI 值，以评价槲皮素和NAC的联合抗肿瘤活性。 CI 值公式如下[14]：

式中：IC50（1）和IC50（2）分别为药物1 和药物2 单独作用时的半数细胞增殖抑制效果所对应的浓度；IC50（C1）和IC50（C2）分别为两药物联用时，产生半数增殖抑制效果时药物1 和药物2 所对应的浓度。

1.4 数据处理

用统计软件SPSS 进行数据分析，试验结果用平均值±标准差（mean±SD）表示，每组试验重复至少3 次；差异显著水平设置为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 槲皮素降解动力学特征

由图1 可知， 初始浓度不同的槲皮素在培养液中的浓度Ct随时间t 都呈指数下降趋势。因此，考虑将试验数据分别进行零级，一级，二级降解动力学方程拟合， 结果表明槲皮素的降解符合一级降解动力学特征。 因此，槲皮素（Que）的降解过程可作如下解释：

降解速率方程微分形式为：

用Ct替代Ct（Que），化简为：

公式4 不定式积分：

将lnCt对时间t 作直线图，斜率为-kobs，这是一级反应方程的重要特征，再对公式（5）作定积分，可得公式6：

积分可得公式7：

槲皮素的初始浓度C0和降解时间t 下的浓度Ct可以计算出kobs（表观速率常数），并用公式（7）将试验数据进行拟合，结果表明ln（Ct/C0）与t 之间存在良好的线性关系（R2＞0.98）（表2），所以具有不同初始浓度的槲皮素， 它的降解均符合一级降解动力学特征。

图1 槲皮素在培养液中的浓度随时间变化散点图Fig.1 Scatter plot of change in concentration of quercetin in medium over time

图2 可知，当槲皮素的初始浓度从50 μmol/L增加到250 μmol/L，kobs并不会随着槲皮素初始浓度的增加而发生显著变化， 这是一级降解反应的又一个重要特征[15]。 由此可知，槲皮素的降解半衰期与其初始浓度无关，只与kobs相关。因此，槲皮素在培养液中的降解是恒定的，如何减小kobs是提高槲皮素稳定性的关键所在。

2.2 NAC 对槲皮素降解速率的影响

从图3 可知，在含有不同浓度NAC 的培养液中， 槲皮素的浓度Ct随时间t 依旧呈指数下降变化，进一步拟合图3 的数据，得到一级动力学曲线（图4），其相关系数均大于0.95（表3），所以ln（Ct/C0）和时间t 之间存在较好的线性关系。因此，槲皮素在不同NAC 浓度条件下的降解仍符合一级降解动力学特征。

从图5 可知，在不含NAC 的培养液中，槲皮素的kobs为（0.9434 ± 0.072）h-1，而在含1 mmol/L NAC 的培养液中，槲皮素的kobs减小为（0.5021 ±0.051）h-1， 并且NAC 浓度越高， 槲皮素的kobs越小。当NAC 的浓度达到5 mmol/L 时，槲皮素的kobs则减小为（0.1711 ± 0.029）h-1，降解时间也从4 h延长到了16 h。 所以，NAC 能减小槲皮素在培养液中的降解速率， 提高槲皮素在培养液中的稳定性。

图2 初始浓度对槲皮素在培养液中降解速率的影响Fig.2 Effect of initial concentration on degradation rate of quercetin in culture medium

表2 不同初始浓度槲皮素（Que）在培养中降解的线性回归决定系数（R2）Table 2 Linear regression coefficient of determination （R2）of different initial concentrations of quercetin （Que）in the culture medium

表3 槲皮素（Que）在含NAC 培养液中降解的线性回归决定系数（R2）Table 3 Linear regression coefficient of determination （R2）of quercetin （Que）in cultrue medium containing NAC

图3 槲皮素在含NAC 的培养液中的浓度随时间变化散点图Fig.3 Scatter plot of change in concentration of quercetin in culture medium containing NAC over time

图4 槲皮素在含NAC 的培养液中的一级降解动力学曲线Fig.4 First-order plots for degradation of quercetin in culture medium containing NAC

图5 NAC 浓度对槲皮素降解速率的影响Fig.5 The effect of NAC on the degradation rate of quercetin in the medium

细胞培养液模拟细胞在体内生存的生理环境，是维护组织细胞生长，进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液，包含细胞所需的氨基酸、蛋白质、糖类、维生素等物质。研究表明，槲皮素在培养液中的降解速度大于在PBS 中的降解速度[16]， 并且槲皮素在培养液中主要发生氧化降解[7,17]。 这是因为槲皮素B 环的邻苯二酚结构是良好的供氢体， 是活性自由基最先攻击的部位[18]；C 环的共轭结构（C2=C3，C4=O）也易被活性自由基进攻，形成稳定的槲皮素酚氧自由基离域[19]；C 环3 位的-OH 则有助于槲皮素被氧化后形成更多共振结构使其更加稳定[20-21]。 抗坏血酸和半胱氨酸能有效抑制槲皮素在pH 8.0 的磷酸缓冲液中的分解[22]。NAC 作为一种强有效的抗氧化剂，可以通过提供H＋离子，中和氧自由基发挥直接抗氧化作用[23]，理论上也能抑制槲皮素的氧化降解。综上，不管是理论还是实践均表明，NAC能降低槲皮素的降解反应速率，提高槲皮素在细胞培养液中的稳定性。

2.3 槲皮素与NAC 的联合抗肿瘤活性

浓度搭配比例会影响两化合物联合作用的效果[24]，图6 给出了槲皮素与NAC 联用对4 种细胞的增殖抑制作用， 不同于槲皮素的浓度单位为μmol/L，NAC 的浓度单位为mmol/L，则NAC 对肿瘤细胞具有较低的毒性作用。当NAC 的浓度小于等于5 mmol/L 时，其对4 种肿瘤细胞几乎没有产生毒性作用（细胞增殖抑制率小于10%）。 5 mmol/L NAC 对Caco-2、HepG-2、MKN-28 和MDAMB-231 细胞的增殖抑制率分别为2.14% ±0.56%，3.89%±0.37%，5.41%±0.73%和2.25% ±0.78%，100 μmol/L 槲皮素对Caco-2、HepG-2、MKN-28 和MDA-MB-231 细胞的增殖抑制率分别为30.17% ± 3.16%，43.19% ± 4.23%，30.22% ±4.22%和15.27%±2.13%，但是5 mmol/L NAC 联合100 μmol/L 槲皮素对Caco-2、HepG-2、MKN-28 和MDA-MB-231 细胞的增殖抑制率分别增加至44.26% ± 3.41%，70.26% ± 4.88%，48.34% ±3.38%和22.76%±3.40%。因此，在NAC 不产生细胞毒性的浓度范围内，NAC 能显著提高槲皮素对4 种肿瘤细胞的抗肿瘤活性。

槲皮素联合其它活性物质的抗肿瘤活性研究已较为丰富， 槲皮素联合山萘酚对人体肠癌细胞HuTu-80、Caco-2 和乳腺癌细胞PMC42 有协同抗增殖作用[25]。 槲皮素和10-羟基喜树碱联用对MCF-7、BGC-823 和HepG-2 肿瘤细胞均具有协同抗增殖作用[26]。 而槲皮素与NAC 的联合抗肿瘤活性未见报导，本研究首次对槲皮素与NAC 的联合抗肿瘤活性进行评价， 结果表明槲皮素联合NAC 能产生强于其各自作用时的抗肿瘤活性。

图6 槲皮素（Que）联合NAC 对Caco-2（a）、MKN-28（b）、HepG-2（c）、MDA-MB-231（d）4 种肿瘤细胞的增殖抑制作用（平均值±标准差，n=3）Fig.6 Antiproliferative effect of quercetin （Que）combined with NAC on Caco-2 （a），MKN-28 （b），HepG-2 （c）, MDA-MB-231 （d）cancer cells （mean±SD， n=3）

表4 给出同一浓度NAC 与不同浓度槲皮素联用时，槲皮素的半数抑制浓度（IC50）和两者的联合指数（CI），随着NAC 浓度的增加，槲皮素的IC50值呈快速下降的趋势。 此外，槲皮素与NAC 的联合指数都基本小于1，表现出良好的联合效果，其中，槲皮素联合NAC 对HepG-2 细胞的联合指数CI 整体小于其它3 种细胞。 因此，在这4 种肿瘤细胞中，槲皮素联合NAC 对HepG-2 细胞表现出最优的抗肿瘤活性。

表4 NAC 联合槲皮素（Que）作用24 h，槲皮素的半数抑制浓度（IC50）以及两者的联合指数（CI）（平均值±标准差, n=3）Table 4 The IC50 of quercetin and combination index （CI）after cells treated with NAC combined with quercetin （Que）for 24 h （mean±SD， n=3）

3 结论

在不含NAC 的培养液中， 槲皮素的kobs为（0.9434±0.072）h-1，而当培养液中的NAC 浓度从1 mmol/L 增加到5 mmol/L 时， 槲皮素的kobs从（0.5021±0.051）h-1降低到 （0.1711 ±0.029）h-1。因此，NAC 能减小槲皮素在培养液中的降解速率，提高槲皮素在培养液中的稳定性。 另一方面，由CI 值基本小于1 可知， 槲皮素联合NAC 对HepG-2、Caco-2、MDA-MB-231 和MKN-28 4 种肿瘤细胞均表现出优于其各自作用时的抗肿瘤活性，其中槲皮素联合NAC 对HepG-2 细胞的抗肿瘤活性明显高于其它3 种细胞。