沙棘总黄酮抑制肺癌A549增殖和迁移作用及机理

贾 丛，杜亚蓉,2*，孙 坤*

1西北师范大学 生命科学学院；2中国科学院 近代物理研究所，兰州 730000

沙棘隶属于胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(Hippophae)，为小乔木或灌木。沙棘黄酮类化合物是沙棘最重要的活性成分之一，其单一黄酮类化合物以槲皮素、异鼠李素、山奈酚为主。具有抗肿瘤[1]、抗炎[2]、保护心脑血管[3]、提高机体免疫力[4]等方面的功效。肺癌是目前世界上最常见的癌症之一，具有发病率高、死亡率高等特点，其死亡率较高的主要原因是肺癌患者在首次诊断后经常发生转移和产生放化疗抗性[5]。近年来，沙棘在抗肿瘤方面的研究工作逐渐得到认可，且沙棘总黄酮的肠吸收特性明显优于单一黄酮类化合物异鼠李素[6]。已有研究证明，沙棘中黄酮类化合物对结肠癌HT29细胞[7]，前列腺癌PC-3细胞[1]，乳腺癌Bcap-37细胞[8]等多种肿瘤细胞都具有抑制作用。在非小细胞肺癌中，黄酮类化合物对顺铂等一些化疗药物有增敏作用[9]。本研究以沙棘属的3种沙棘植物为材料，检测其总黄酮对A549增殖的抑制作用，进一步分析西藏沙棘总黄酮对肺癌细胞侵袭和迁移能力的影响，并初步探讨了相关分子机制，以期为高效开发利用沙棘资源提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

中国沙棘叶采自甘南藏族自治州阿万仓，西藏沙棘叶、肋果沙棘叶均采自青海省祁连县，经西北师范大学孙坤教授鉴定为西藏沙棘(H.tibetanaSchlecht.)、中国沙棘(H.rhamnoidesL.subsp.sinensisRousi)、肋果沙棘(H.neurocarpassp.neurocarpa)。

1.1.2 实验试剂

甲醇及乙醇(国药集团)；芦丁标准品(北京Solarbio公司804D0218)；槲皮素、异鼠李素、山奈酚标准品(上海源叶公司)；RPMI-1640培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(兰州荣晔公司)；MTT(美国Spectrum Chemical公司)；jetPRIME®转染试剂(法国PolyPlus-transfection公司)；DMSO(美国Sigma公司)；RIPA细胞裂解液(Biosharp公司)；AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(Becton Dickinson公司)；MMP9、MMP2、TGF-β、E-cadherin、N-cadherin等5种抗体(Proteintech公司)，山羊抗兔IgG(中杉金桥公司)。

1.1.3 实验仪器

流式细胞仪(Backman moflo XDP，美国)；倒置显微镜(Moticam 2306，中国)；二氧化碳培养箱(Thermo Scientific 311，美国)；凝胶成像系统(Tanon 4200，中国)；酶标仪(Tecan Infinite M200Pro，瑞士)；色谱柱(SunFire C18，美国)；色谱仪(QuiksepP0050d-11，北京)。

1.2 实验方法

1.2.1 总黄酮提取

准确称取干燥粉碎后的三种沙棘叶片各30 g，采用溶剂提取法，以固液比为1∶10的比例加入无水甲醇，40 ℃冷凝回流提取1 h，过滤，重复以上操作3次，并收集总和3次提取液。

1.2.2 总黄酮纯化

用石油醚萃取叶绿素及脂溶性杂质后采用聚酰胺进行分离纯化。将萃取后的沙棘提取液置于旋转蒸发仪中进行浓缩至无醇后用蒸馏水溶解。过粒径为100目聚酰胺层析柱，先用蒸馏水洗去杂质，后用70%～100%乙醇进行梯度洗脱，收集洗脱液。减压浓缩至干燥。

1.2.3 总黄酮含量测定

1.2.3.1 芦丁标准曲线绘制

用25 mL 30%乙醇定容溶解5 mg芦丁标准品，配置为0.2 mg/mL的标准母液备用。准确吸取标准液0、1、2、3、4、5、6 mL于25 mL容量瓶中，加30%乙醇至10 mL，混合均匀后加5% NaNO2溶液1 mL，充分摇匀后静置，吸取10% Al(NO3)31 mL混匀，6 min后再加入10 mL 1 mol/L的NaOH溶液，30%乙醇的定容至标准线，置室温15 min。510 nm处测定三种沙棘醇提总黄酮吸光值。标准曲线以吸光度作为纵坐标y，浓度为横坐标x进行分析绘制。

1.2.3.2 总黄酮含量测定

吸取10 mL已用30%乙醇溶解的沙棘总黄酮样品，置于25 mL容量瓶中，采用芦丁标曲方法测样品510 nm处吸光值，代入标曲方程，计算三种沙棘总黄酮含量。

1.2.3.3 HPLC法测定三种沙棘总黄酮样品中主要黄酮苷元含量比例关系

选用色谱柱(5 μm，4.6×250 mm)。流动相为甲醇、水(52∶48)，设置柱温30 ℃，检测波长370 nm，流速1 mL/min洗脱40 min。样品进样量为10 μL。

1.2.4 细胞培养

选取人非小细胞肺癌A549细胞系，用RPMI-1640培养基进行细胞培养。细胞需置于饱和湿度含5% CO2的37 ℃培养箱中进行培养。待细胞增长至对数期时，用胰酶对细胞进行消化传代。

1.2.5 MTT检测细胞相对活力

三种沙棘总黄酮用DMSO配成母液，实验时用RPMI1640培养基稀释至相应的浓度。消化对数生长期的细胞，稀释细胞密度至5 000 个/孔接种于96孔培养板，置37 ℃、5% CO2的培养箱培养。待细胞贴壁12 h后，分别加入含有不同浓度(20、40、60、80、100 μg/mL)的沙棘总黄酮，对照组加入与实验组同等质量浓度的DMSO。干预培养48 h后，加入20 μL MTT溶液，置于培养箱中继续孵育4 h，移除培养基，150 μL DMSO加入各实验孔，避光震荡溶解。酶标仪570 nm处测定各孔吸光度值。

1.2.6 平板克隆形成实验检测克隆形成

将各组对数生长期的A549细胞消化，稀释细胞密度为100 个/皿接种于60 mm培养皿中。实验组选择三种沙棘总黄酮的IC50值(西藏沙棘64.75 μg/mL、中国沙棘76.85 μg/mL、肋果沙棘95 μg/mL)处理A549细胞，阴性对照组加入含有与实验组相同浓度的DMSO的完全培养基，培养48 h后，更换新鲜完全培养基继续培养10～14天，定期更换培养基，待出现肉眼可见克隆时终止培养，固定，结晶紫染色后计数统计。

1.2.7 软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成

配制1%及0.7%琼脂糖，高压灭菌后置于38 ℃水浴锅中保持融化状态。配制2倍浓度RPMI培养基并加入20%FBS，置于38 ℃水浴锅中加热。以1∶1的比例充分混合1%琼脂糖及培养基，吸取3 mL均匀铺于60 mm培养皿底部，冷却凝固。准备细胞，实验分组与“1.2.6”一致，培养48 h后，消化细胞，调整细胞密度5 000个/皿，等比例与0.7%琼脂糖混合，吸取3 mL铺于下层胶上。静置冷却凝固。加培养基继续培养，并隔天更换一次新鲜培养基，30天后统计细胞克隆数。

1.2.8 流式检测细胞凋亡

实验分组与“1.2.6”一致，消化收集细胞。采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡，遵照BD凋亡检测试剂盒使用说明，进行染色，利用流式细胞仪上机检测A549细胞发生凋亡的比例。

1.2.9 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

消化对数生长期的细胞，接种于细胞培养皿中，实验组加入含有64.75 μg/mL西藏沙棘总黄酮的RPMI1640培养基，对照组加入同等质量浓度的DMSO。干预处理48 h。消化细胞，稀释细胞数量为106个/孔接种于6孔板中。待细胞贴壁且铺满板底后，用200 μL移液器垂直板底划线。用PBS清洗至无漂浮细胞，再加入无血清培养基。培养0、24、48 h后，光学显微镜下进行观察拍照。

1.2.10 Transwell实验检测细胞迁移能力

实验分组与“1.2.9”一致，干预培养48 h后消化细胞，置于离心管中离心，吸掉培养基，加无血清培养基将细胞稀释成7 000/200 μL。取200 μL加入Transwell小室内，小室外加入含血清培养基650 μL。放入培养箱培养24 h。无水甲醇固定40 min，吸除甲醇，结晶紫染色60 min，用脱脂棉擦除小室内侧细胞。在光学显微镜下进行拍照，计数迁移细胞数，4倍物镜下整体拍照小室内所有的细胞。

1.2.11 Transwell实验检测细胞侵袭能力

将基质胶用无血清培养基按1∶8的比例进行稀释。Transwell小室中加100 μL稀释胶，培养箱放置至凝固。64.75 μg/mL西藏沙棘总黄酮干预培养48 h消化细胞，吸取1 mL于15 mL离心管中离心，吸掉培养基，加无血清培养基将细胞稀释成2万/100 μL，吸取100 μL加入到小室中，放入培养箱培养48 h。固定、染色、计数方法与“1.2.10”一致。

1.2.12 Western blot检测蛋白表达

实验组加入含有64.75 μg/mL西藏沙棘总黄酮，对照组加入同等质量浓度的DMSO，培养48 h后，培养皿中加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液收集各实验组蛋白，超声离心后收集上清为蛋白样品。采用Bradford法测定蛋白浓度。按照一定比例混匀收集的蛋白样品及SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10 min。制备分离胶与浓缩胶，蛋白上样30 mA恒流电泳，130 mA恒流转膜180 min，用5%的牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h后，置于一抗中4 ℃过夜孵育，TBS洗液漂洗3次，置于二抗中孵育1 h，再次漂洗3次，显影后，拍照记录相关条带。

1.2.13 RNA干扰抑制E-cadherin基因的表达

采用RNA干扰手段抑制A549细胞系中E-cadherin的表达，将A549细胞消化计数，以10万/皿接种于35 mm培养皿中，待细胞达到转染密度，加入配置好SiRNA转染试剂复合物，培养6 h后换正常培养基，继续培养48 h，Western blot检测干扰抑制效率。

1.3 数据统计分析

2 实验结果

2.1 三种沙棘总黄酮对A549细胞相对活力影响

MTT检测结果如图1所示，将20～100 μg/mL的三种沙棘总黄酮(TFH)作用于A549细胞48 h后，其细胞存活率较对照组都有显著性降低(P<0.001)。将三种沙棘总黄酮对A549细胞相对活力影响进行统计，发现其细胞活力抑制效果依次为：西藏沙棘>中国沙棘>肋果沙棘。经分析计算西藏沙棘、中国沙棘、肋果沙棘总黄酮其半数抑制浓度IC50值分别为64.75、76.85、95 μg/mL。上述结果表明，西藏沙棘总黄酮对A549细胞活力抑制作用明显优于中国沙棘及肋果沙棘。

图1 三种沙棘总黄酮对A549细胞存活率的影响

2.2 三种沙棘总黄酮对A549细胞平板克隆形成的影响

由图2可知，与对照组相比较，三种沙棘总黄酮均可显著性减少单个A549细胞克隆形成数(P<0.05)。将三种沙棘总黄酮作用后的克隆形成数与对照组进行统计，西藏沙棘总黄酮可减少62%，显著优于中国沙棘的40%及肋果沙棘的16%(P<0.05)。

图2 三种沙棘总黄酮对A549细胞平板克隆形成的影响

2.3 三种沙棘总黄酮对A549细胞软琼脂克隆形成的影响

软琼脂克隆形成结果如图3可知，经沙棘总黄酮处理的A549细胞克隆形成数显著减少(P<0.001)。西藏沙棘、中国沙棘、肋果沙棘的克隆形成数依次减少81%、56%、31%。基于以上分析，我们发现西藏沙棘提取的总黄酮抑制肺癌A549细胞肿瘤形成能力效果最显著。

2.4 三种沙棘总黄酮对A549细胞凋亡的影响

三种沙棘总黄酮对A549细胞凋亡作用结果见表1，与对照组凋亡率4.21%相比，中国及肋果沙棘对A549细胞凋亡无显著差异，细胞凋亡率分别为4.99%、4.94%。西藏沙棘总黄酮作用后，A549细胞凋亡显著升高，凋亡率可达18.46%。但三种沙棘均显著促进细胞坏死率，其促坏死率依次为：西藏沙棘(12.63%)>肋果沙棘(9.78%)>中国沙棘(8.04%)。

图3 三种沙棘总黄酮对A549细胞软琼脂克隆形成的影响

表1 三种沙棘对三种沙棘总黄酮对A549细胞软琼脂细胞凋亡的影响

注：与空白对照组比较，***P<0.001。Note:Compared with control,***P<0.001.

图4 三种沙棘总黄酮对A549细胞凋亡的影响

2.5 三种沙棘总黄酮样品中主要黄酮苷元含量比例关系

经HPLC检测分析结果见表2，提取的三种沙棘总黄酮样品中，异鼠李素在三种苷元总量中占比均大于山奈酚及槲皮素。西藏沙棘中山奈酚∶槲皮素、异鼠李素∶槲皮素的比值均高于中国沙棘和肋果沙棘。肋果沙棘中山奈酚∶槲皮素比值偏低。

2.6 西藏沙棘总黄酮对A549细胞侵袭迁移能力影响

2.6.1 西藏沙棘总黄酮对A549细胞迁移能力影响

首先，我们选用划痕实验检测西藏沙棘总黄酮处理后A549细胞迁移能力。划痕实验结果如图5A所示，与对照组相比，经西藏沙棘总黄酮处理24 h的A549细胞，划痕愈合度显著降低了39%。处理48 h后，较对照组划痕愈合度降低40.5%。上述结果表明，西藏沙棘总黄酮可显著性抑制肺癌A549细胞迁移能力。随后，Transwell实验对划痕实验结果进行验证，由图5B可看出，经西藏沙棘总黄酮处理后，穿膜细胞明显减少。

表2 三种沙棘总黄酮样品中主要黄酮苷元含量比例关系(与槲皮素相比)

图5 西藏沙棘总黄酮对A549细胞迁移能力影响

2.6.2 西藏沙棘总黄酮对A549细胞侵袭能力影响

同样，通过Transwell实验对西藏沙棘总黄酮对A549细胞侵袭能力影响进行评价。由图6可知，西藏沙棘总黄酮可显著性减少A549穿膜数，其侵袭抑制率可达81%。

图6 西藏沙棘总黄酮对A549细胞侵袭能力影响

2.7 西藏沙棘总黄酮对侵袭迁移相关蛋白表达水平的影响

Western blot结果如图7显示，经西藏沙棘总黄酮处理的A549细胞，MMP9、MMP2、TGF-β及N-cadherin表达水平显著性降低。而E-cadherin表达水平上调。

图7 西藏沙棘总黄酮对MMP9、E-cadherin等蛋白表达水平的影响

2.8 西藏沙棘总黄酮对Si-E-cadherin细胞迁移能力影响

SiRNA敲低A549细胞系E-cadherin基因，如图8所示，经Western blot实验验证A549 细胞系中E-cadherin蛋白显著降低，可用于后续实验。

选用Si-E-cadherin细胞再次进行划痕实验。结果如图9A所示，与Si-NC组相比，Si-E-cadherin control组细胞划痕愈合度显著增加了16.3%(P<0.01)，而经西藏沙棘总黄酮处理的Si-E-cadherin细胞逆转上述趋势，划痕愈合度较Si-E-cadherin control组显著降低了17.5%。已经接近Si-NC组的细胞迁移能力。Transwell实验结果如图9B所示，经西藏沙棘总黄酮处理的Si-E-cadherin细胞，细胞穿膜数显著减少(P<0.01)。我们得出结论，西藏沙棘总黄酮可逆转因敲低E-cadherin而引起迁移能力的增强。

Western blot检测西藏沙棘总黄酮对Si-E-cadherin A549细胞系中E-cadherin表达水平影响，结果如图10，经西藏沙棘总黄酮处理的Si-E-cadherin A549细胞中，E-cadherin表达水平升高。

3 讨论

肺癌是我国近年来发病率和病死率均较高的恶性肿瘤之一[5]，其死亡率较高的主要原因有容易复发转移。众所周知，肿瘤细胞的侵袭迁移能力是衡量肿瘤复发转移的关键。肿瘤的转移也是癌症治疗的难点之一。因此迫切需要寻找一种合适的辅助放化疗药物，以期降低转移的风险，显著提高肺癌患者的生存率。近年来，植物衍生化合物成为当今药物研究的热点，因此从药食同源植物或草药中寻找一种低毒副、高抗癌作用的化合物对癌症辅助治疗具有重要的意义。

图8 Western blot检测Si-E-cadherin细胞系中E-cadherin表达水平

图9 西藏沙棘总黄酮对Si-E-cadherin A549迁移能力影响

图10 西藏沙棘总黄酮对Si-E-cadherin A549细胞系中E-cadherin表达水平影响

本研究以沙棘属的3种沙棘植物叶为材料，发现三种沙棘总黄酮均对肺癌A549细胞具有增殖抑制以及促凋亡作用。三种沙棘总黄酮抑制作用依次为：西藏沙棘>中国沙棘>肋果沙棘。有文献报道，沙棘叶总黄酮的黄酮苷元成分以异鼠李素、槲皮素及山柰酚为主[10]。已有研究证实，三种苷元在肺癌A549中均可发挥细胞增殖抑制作用及促凋亡作用，三者可诱导由Bcl-2/Bax介导的线粒体依赖途径的细胞凋亡过程[11-13]。进一步研究发现，在该细胞凋亡过程中，异鼠李素作用机制是通过促进CytoC释放，致使ATP合成停止，从而引发膜电位异常[14]。且发现异鼠李素与槲皮素具有协同增效的作用，按比例混合两者的增殖抑制效果显著优于单一化合物[15]。

HPLC分析检测三种沙棘总黄酮中均含有槲皮素、异鼠李素、山奈酚等黄酮类化合物，但其各黄酮苷元含量比例有明显差异。其中西藏沙棘中山奈酚∶槲皮素、异鼠李素∶槲皮素的比值均远高于中国沙棘和肋果沙棘。三种苷元的抗癌效果不尽相同，就肺癌A549而言，经10 μmol/L异鼠李素处理，其细胞的增殖率即可降至50%左右[16]。山奈酚半数致死浓度为47 μmol/L[12]，而槲皮素为74 μmol/L[13]。本研究中发现西藏沙棘中山奈酚∶槲皮素，异鼠李素∶槲皮素的比值均高于中国沙棘和肋果沙棘，也更好的解释了西藏沙棘总黄酮在抑制增殖作用和侵袭迁移能力具有明显的优势。这一研究结果可为高效开发利用沙棘资源提供实验依据。

进一步的研究中，我们选择西藏沙棘总黄酮研究沙棘总黄酮对A549细胞侵袭迁移作用。本研究表明西藏沙棘总黄酮可显著性抑制肺癌A549细胞迁移侵袭能力。本研究结果提示，沙棘总黄酮具有抑制肺癌细胞转移的潜力，可为晚期肺癌的治疗提供帮助。

肿瘤细胞的侵袭迁移是肿瘤细胞与宿主细胞及细胞外基质的多重作用的结果。E-cadherin的缺失是上皮细胞间质转化的一个主要特征。其表达降低，致使细胞间的粘附能力减弱及细胞极性发生改变，从而导致肿瘤细胞的迁移[17]。在该研究中，沙棘总黄酮可上调E-cadherin表达，且可逆转E-cadherin缺失所导致的迁移增加。由此可证明，沙棘总黄酮通过抑制肺癌EMT，从而抑制侵袭迁移。除此之外，该研究发现经沙棘总黄酮处理的A549细胞，其细胞中的TGF-β、MMP9表达量降低。MMP9是降解细胞外基质的关键成分，通过对基膜中IV型胶原与层粘连蛋白等细胞外基质的降解，从而促进肿瘤对周围组织的浸润侵袭[18]。且已有研究表明，金属蛋白酶MMPs能切割位于细胞表面E-cadherin并将可溶性E-cadherin释放到培养基中，从而影响细胞的侵袭迁移[19]。MMP9表达受不同细胞因子影响，其中包括TGF-β等。作为肿瘤微环境中的重要成分之一的TGF-β，可通过介导MMP9/MMP2，从而影响细胞侵袭迁移[20]。综上所述，本研究认为沙棘总黄酮通过降低细胞中的TGF-β抑制MMP9表达并阻止肺癌EMT来抑制A549侵袭迁移。