化湿败毒方治疗新型冠状病毒肺炎的药理学机制探讨和网络药理学研究

赖庆来，梁爱武，何妙仪，黄小玉，吴伟泳

广西中医药大学附属瑞康医院，南宁 530011

2019年底湖北省武汉市出现新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎)的疫情，此次疫情比较严重，传染性极强，传染源主要为新型冠状病毒感染患者和无症状感染者。2020年1月31日，世界卫生组织正式将其命名为COVID-19[1]。国家卫生管理部门采取重要措施，发布了COVID-19相关方诊疗方案，要求发挥中医中药治疗和预防作用，并且加强中医和西医相互联合治疗作用，共同发挥各自优势，使此次医疗救治取得最好效果。从中医学角度分析，此次COVID-19病位主要在肺脾，病机特点主要以“湿、热、毒”相关，根据病情特点提出分期辨证论治[2]。而中医临床具有辨证论治的特色优势，能够因人制宜采取不同的治疗措施。

化湿败毒方是国家卫生健康委员会和国家中医药管理局联合发布的《新冠肺炎诊疗方案(试行第七版)》治疗推荐方，用于COVID-19辨证为疫毒闭肺证的治疗。该证临床主要表现为发热、咳嗽、痰黄或痰中带血、气喘、乏力、口干苦、恶食欲差、大便不畅，小便短赤，舌红、苔黄腻、脉滑数。化湿败毒方在临床中运用效果明显，目前此方已由黄璐琦院士为领队的第一批国家援鄂抗疫中医医疗队(中国中医科学院)研制成化湿败毒颗粒。2020年3月18日，化湿败毒颗粒获临床试验批件。化湿败毒方传承了中医理论的精华，由麻杏石甘汤、藿香正气散、宣白承气汤、葶苈大枣泻肺汤多个经典名方加减而来。但化湿败毒方对COVID-19的作用机制尚未能明确阐明，对化湿败毒方的有效应用带来了局限。本研究对化湿败毒方治疗COVID-19的现代药理学机制进行探讨，然后运用网络药理学方法预测化湿败毒方治疗COVID-19的作用机制研究，并借助分子对接技术进行验证，旨在为中医药治疗COVID-19的研究提供进一步科学依据。

1 材料与方法

1.1 化湿败毒方现代药理学机制研究

查阅文献以及临床报道，总结化湿败毒方治疗COVID-19药理学研究。

1.2 有效成分的收集及潜在靶点的预测

以化湿败毒方中单味中药标准名称为检索词，在TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.Php)数据库检索化湿败毒方的全部化学成分，根据药代动力学(ADME)：口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18进行筛选[3]，得到化湿败毒方有效成分和相应的靶标蛋白。COVID-19靶点的预测，以“Novel Coronavirus Pneumonia”为关键词，检索GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库，选择物种为“Homo sapiens”，检索出与COVID-19相关的基因。

1.3 化湿败毒方治疗COVID-19潜在作用靶点预测

通过R语言3.6.2程序取交集将药物预测的靶点与疾病的靶点进行映射，获得“化湿败毒方”治疗COVID-19的潜在作用靶点，并绘制韦恩图。

1.4 交集靶标的蛋白网络互作(PPI)构建

为明确潜在作用靶点之间的相互作用关系，将得到的共同靶点导入STRING(https://string-db.org/)网络平台数据库，物种仅限于“智人”，置信度>0.9为条件进行筛选，获得蛋白互作关系。通过Cytoscape3.7.0软件构建并可视化PPI交互网络，根据PPI中节点的平均“degree”值为最低标准筛选核心蛋白。

1.5 基因富集分析

为了深入了解化湿败毒方治疗COVID-19的生物过程及通路信息，利用R语言3.6.2程序基于“bioconductor”数据包提取信息，对靶点进行GO(geneontology)生物学过程富集分析和KEGG(KEGG pathway analysis)通路富集分析，筛选条件设定阈值P<0.05，得到靶点蛋白在基因功能和信号通路中的作用。

1.6 构建化合物-靶点网络图

将收集的药物，活性成分及收集的交叉靶点，利用Cytoscape3.7.0软件绘制“构建化合物-靶点网络图。

1.7 成分-靶点分子对接

从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载SARS-CoV-2 3CL水解酶(PDB ID：6LU7)和血管紧张素转化酶II(ACE2)(PDB ID：1R42)的3D结构PDB格式文件，利用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库下载化湿败毒方排名前三活性成分的3D结构，使用Autodock-4.2软件进行。将蛋白导入，并对其加氢、加电荷等处理，然后将受体和配体进行分子对接，最后利用PyMOL对结果进行分析及可视化。

2 结果

2.1 化湿败毒方现代药理学研究

虽然新冠肺炎的发生机制尚不明确，但病毒感染及感染后的炎症过程是明确的，因此,抗炎与抗病毒是治疗的关键，化湿败毒方由麻杏石甘汤、藿朴夏苓汤、宣白承气汤、葶苈大枣泻肺汤多个经典名方加减而来，这些方剂大部分均有抗炎及抗病毒作用。

2.1.1 抗炎作用

相关研究研究表明，麻杏石甘汤可以减轻肺部炎症，主要通过提高机体的免疫能力，调节细胞因子的表达和分泌相关方面，可以明显改善流感病毒性肺炎小鼠的一般状况[4]。化湿败毒方中藿朴夏苓汤，在抗炎、调节免疫具有重要作用，研究表明，藿朴夏苓汤具有抑制炎症作用，能降低TNF-α、IL-6等炎症细胞因子的含量，抑制NF-κB炎症通路的表达[5]。化湿败毒方中宣白承气汤有抗炎作用，可以改善重症肺炎患者的白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α水平，从而提高免疫功能，增强抗病能力[6]。葶苈大枣泻肺汤可通过提高机体的免疫功能，减轻血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)水平的影响，从而减轻从而减轻肺部炎症[7]。这些研究为化湿败毒方抗病毒作用提供了依据。

2.1.2 抗病毒作用

化湿败毒方中麻杏石甘汤具有抗炎，抗病毒和调节免疫功能等方面作用，麻杏石甘汤发挥抗病毒作用主要表现在能够下调流感病毒感染的巨噬细胞IFN-α、IFN-β分泌水平和蛋白表达水平[8]。网络药理学研究表明，麻杏石甘汤里面不同的化学成分，作用在靶标蛋白上，形成一个分子网络，对病毒入侵、病毒复制及继发炎症因子造成多器官损伤起作用，同时对侵袭过程进行截断，以调控宿主免疫进行抗感染[9]。现代药理研究发现，藿朴夏苓汤中藿香，其主要活性成分有广藿香醇、广藿香酮，均具有显著的抗炎、抗病毒作用，能很好抑制病毒的活性[10]。网络药理学研究表明，藿朴夏苓汤通过菲酮、黄芩苷、酸枣仁皂苷等主要活性化合物，具有潜在的抗SARS-CoV-2作用，可能通过阻断SARS-CoV-2病毒蛋白合成，起到抗病毒治疗作用[11]。

现代药理学研究也证实了该方中的多个构成方剂具有抗炎、抗病毒、调节免疫的功能，是目前公认的治疗新冠肺炎疗效确切的中药方剂，这些研究为化湿败毒方抗病毒作用提供了依据。

2.2 化湿败毒方在治疗COVID-19有效成分及其靶点筛选结果

通过检索TCMSP数据库最终筛选收集到化湿败毒方药物中13味药(石膏未收集在数据库内)，共有269个有效活性成分纳入本次研究，其中麻黄23个、苦杏仁19个、广藿香11个、厚朴2个、苍术9个、草果8个、半夏13个、茯苓15个、大黄16个、黄芪20个、葶苈子12个、赤芍29个、甘草92个，部分关键活性化合物见表1。对这些药物靶点预测，去重后提取到靶点基因261个。

表1 化湿败毒方部分活性化合物基本信息

续表1(Continued Tab.1)

材料Herb分子号MOLID活性成分Moleculename口服生物利用度OB(%)类药性DLMOL005190Eriodictyol71.790.24MOL004328Naringenin59.290.21杏仁AlmondMOL010921Estrone53.560.32MOL010922Diisooctylsuccinate31.620.23MOL00221111,14-Eicosadienoicacid39.990.20MOL002311Glycyrol90.780.67MOL004841LicochalconeB76.760.19MOL005017Phaseol78.770.58MOL007207Machiline79.640.24MOL012922l-SPD87.350.54藿香AgastacherugosaMOL002879Diop43.590.39MOL005890Pachypodol75.060.40MOL0059115-Hydroxy-7,4′-dimethoxyflavanon51.540.27MOL005916Irisolidone37.780.30MOL005918Phenanthrone38.700.33MOL005921Quercetin7-O-β-D-glucoside49.570.27厚朴MagnoliaMOL005970Eucalyptol60.620.32MOL005980Neohesperidin57.440.27苍术AtractylodeslanceaMOL000173Wogonin30.680.23MOL000184Nsc6355139.250.76MOL000186Stigmasterol3-O-beta-D-glucopyranoside_qt43.830.76MOL0001883β-acetoxyatractylone40.570.22MOL000085Beta-daucosterol_qt36.910.75MOL000088Beta-sitosterol3-O-glucoside_qt36.910.75MOL000092Daucosterin_qt36.910.76MOL000094Daucosterol_qt36.910.76草果TsaokoMOL000073Ent-Epicatechin48.960.24MOL000074(4E,6E)-1,7-bis(4-hydroxyphenyl)hepta-4,6-dien-3-one67.920.24MOL000085Beta-daucosterol_qt36.910.75MOL000088Beta-sitosterol3-O-glucoside_qt36.910.75MOL000096(-)-Catechin49.680.24MOL000098Quercetin46.430.28半夏PinelliaMOL00175524-Ethylcholest-4-en-3-one36.080.76MOL002670Cavidine35.640.81MOL000449Stigmasterol43.830.76MOL00693610,13-Eicosadienoic39.990.20MOL00693712,13-Epoxy-9-hydroxynonadeca-7,10-dienoic42.150.24茯苓PoriacocosMOL000275Trametenolicacid38.710.80MOL0002767,9(11)-Dehydropachymicacid35.110.81

续表1(Continued Tab.1)

材料Herb分子号MOLID活性成分Moleculename口服生物利用度OB(%)类药性DLMOL000282Ergosta-7,22E-dien-3beta-ol43.510.72MOL000283Ergosterolperoxide40.360.81MOL000290PoricoicacidA30.610.76MOL000296Hederagenin36.910.75MOL000300Dehydroeburicoicacid44.170.83大黄RhubarbMOL002235Eupatin50.800.41MOL002251Mutatochrome48.640.61MOL002259Physciondiglucoside41.650.63MOL002260ProcyanidinB-5,3′-O-gallate31.990.32MOL002281Toralactone46.460.24MOL002280Torachrysone-8-O-beta-D-(6′-oxayl)-glucoside43.020.74MOL002293SennosideD_qt61.060.61MOL002303PalmidinA32.450.65MOL000471Aloe-emodin83.380.24黄芪AstragalusMOL000211Mairin55.380.78MOL000239Jaranol50.830.29MOL000296Hederagenin36.910.75 MOL000354Isorhamnetin49.600.31MOL0003713,9-Di-O-methylnissolin53.740.48MOL0003787-O-Methylisomucronulatol74.690.30MOL000392Formononetin69.670.21MOL000398Isoflavanone109.990.30MOL000422Kaempferol41.880.24MOL000439Isomucronulatol-7,2′-di-O-glucosiole49.280.62MOL000098Quercetin46.430.28葶苈子LepidiaseedMOL00221111,14-Eicosadienoicacid39.990.20MOL000296Hederagenin36.910.75MOL000358Beta-sitosterol36.910.75MOL003908Cynotoxin99.940.78赤芍RedPeonyMOL001918Paeoniflorgenone87.590.37MOL001925Paeoniflorin_qt68.180.40MOL000358Beta-sitosterol36.910.75MOL004355Spinasterol42.980.76MOL000492(+)-Catechin54.830.24MOL006992(2R,3R)-4-methoxyl-distylin59.980.30MOL007003Benzoylpaeoniflorin31.140.54MOL007004Albiflorin30.250.77MOL0070148-Debenzoylpaeonidanin31.740.45MOL007022EvofolinB64.740.22

续表1(Continued Tab.1)

材料Herb分子号MOLID活性成分Moleculename口服生物利用度OB(%)类药性DLMOL007025Isobenzoylpaeoniflorin31.140.54MOL002883Ethyloleate(NF)32.400.19MOL005043Campest-5-en-3beta-ol37.580.71甘草 LicoriceMOL005012Licoagroisoflavone57.280.49MOL004948Isoglycyrol72.670.59MOL000098Quercetin46.430.28

2.3 COVID-19潜在靶点的预测

通过检索GeneCards数据库，得到COVID-19相关靶标有251个。将化湿败毒方和COVID-19潜在靶点进行映射取交集共得到49个交叉靶点，即化湿败毒方治疗COVID-19潜在作用靶点(见图1)。

图1 化湿败毒方与COVID-19靶点的韦恩图

2.4 PPI网络与核心靶点

化湿败毒方PPI网络图(图2)。图中共涉及个49节点、576条边，其中节点越大度值越大，边的粗细反应连接评分，边越粗评分越高，关系越密切，颜色由蓝变黄程度与度值和介值均呈正相关。靶蛋白平均节点度值为12.25，超过平均度值的靶蛋白有20个，对排名前30的靶点蛋白进行统计并绘制条形图(图3)。结果显示IL6、MAPK8、MAPK1、IL1B、RELA、CASP3等靶蛋白可能是化湿败毒方防治COVID-19疾病的潜在关键靶点。

2.5 GO生物功能注释及KEGG通路富集

利用R语言3.6.2程序基于bioconductor等数据包提取信息，设定阈值P<0.05，GO富集分析包括1 547条生物过程(biological process，BP)、29条细胞组分(cellular component，CC)以及86项分子功能(molecular unction，MF)。对排名前20的GO富集分析，如图4(A-C)所示。

图2 化湿败毒方作用COVID-19交集靶点的PPI网络

图3 化湿败毒方作用COVID-19关键核心靶蛋白

图4 核心靶点的GO富集分析

BP分析(图4A)可以看出，这些靶点主要涉及对脂多糖的反应、细胞对细菌来源分子的反应，细胞对生物刺激的反应，氧化应激反应等生物过程。

CC分析(图4B)可以看出，靶点主要涉及膜筏、膜微结构域、膜区、粘着斑等细胞组分。

MF分析(图4C)中可以看出，靶点主要涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、磷酸酶结合，BH结构域结合、死亡域、磷酸酶结合等分子功能。

根据设定阈值P<0.05为筛选条件，KEGG通路富集筛选得到156条信号通路，以富集基因数目进行排序，排名前20的通路(如图5)所示，主要富集在卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、甲型流感、IL-17通路、TNF通路、AGE-RAGE通路等，这些通路发挥抗病毒、抗炎、免疫调节等作用，说明化湿败毒方主要活性成分的作用靶点分布在不同的代谢通路，多成分、多靶点相互调节是治疗COVID-19的可能机制。

图5 核心靶点的KEGG通路富集分析

2.6 化合物-靶点网络图

将收集的药物的活性成分及收集的交叉靶点，利用Cytoscape3.7.0软件绘制“化合物-靶点”网络图。如(图7)所示，长方形代表化湿败毒方预测靶点活性成分，椭圆形代表活性成分，节点之间的边表示成分与靶点之间的相互作用关系。根据网络拓扑分析结果，以节点度值的平均数作为筛选标准，同时参考其中心度值，对化学成分和靶点进行排序，其中排名较前主要核心化合物为：槲皮素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素、柚皮素、β-谷甾醇、黄芩素等，靶点排名较前主要有IL6、MAPK8、MAPK1、IL1B、RELA、CASP3等靶点。

图6 化合物-靶点网络图

2.7 化湿败毒方有效成分作用于COVID-19 3CL水解酶及ACE2的分子对接结果

一般配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性大，一般以结合能(binding energy)≤-5.0 kJ/mol为筛选标准，本文将网络拓扑分析所得度值排名前三的核心化合物(因石膏未收集在TCMSP数据库，此处将石膏有效成分碳酸钙纳入分子对接进行筛选)与SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受体进行分子对接，对接结果显示(表2)，提示排名前三核心化合物与受体结合活性较高，对接情况(图8)所示。并与目前临床使用的抗病毒药物洛匹那韦、瑞德西韦比较，其结合能未见显著差异。由此可见这些核心化合物与受体蛋白形成构象能量低，结构稳定，结合活性较高。

表2 化湿败毒方活性成分与3CL水解酶和ACE2的对接结果

图7 化湿败毒方核心活性化合物与3CL水解酶、ACE2的分子对接模式

3 讨论

COVID-19为感受“疫疠”之邪而发生的一种急性传染病，目前根据全国疫情流行情况，结合临床症状分析可将COVID-19归属于中医“疫病”范畴[2]。目前临床COVID-19可分为轻型、普通型、重型、危重型四个分型，其中重型COVID-19的治疗非常关键，是疾病好转或者加重的分岭点，如果不能及时有效治疗可能发展为危重型，甚至出现死亡。重型COVID-19推荐使用化湿败毒方治疗，此方具有攻补兼施，扶正祛邪作用，发挥中医扶正与祛邪治疗的特点，有效缓解病情,最终达到治愈疾病的目标[19]。中医药在治疗传染病中有较好的预防和治疗作用，中医药以其独特的疗效起到重要作用，引起关注和肯定。在此次疫情防治工作中，中医药显示了独特的优势。

本研究采用网络药理学的方法筛选出化湿败毒方核心化合物主要有槲皮素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素、柚皮素、β-谷甾醇、黄芩素等。其中槲皮素度值最大，靶点数最多，说明其作用可能最显著。槲皮素主要作用有消炎、抗病毒和免疫调节等药理学作用，其作用机理主要阻止病毒受体复合物不能进入细胞，从而导致病毒死亡[12]。木犀草素具有抗病毒、消炎、抗氧化等相关方面作用，相关动物研究实验表明，木犀草素可减少肿瘤坏死因子α的释放，同时还有抑制肺组织间的炎症作用[13]。研究发现，山奈酚能通过降低MAKP、NF-κB等通路的活性来抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等的相关炎症因子表达水平，起到抗炎作用[14]。汉黄芩素可抑制体内补体系统的过度激活，改善病毒导致急性肺部损伤的作用[15]。柚皮素作用功能多，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗纤维化、免疫调节等多种药理活性[16]。β-谷甾醇和黄芩素均具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫等药理作用[17,18]。综上化湿败毒方的主要化合物基本都具有抗病毒、抗炎、调节免疫力的作用。

为了进一步进行分子对接以寻求化湿败毒方治疗COVID-19的物质基础，将排名前三的核心化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受体进行分子对接。而研究发现，SARS-CoV-2是一种RNA冠状病毒，其通过3CL水解酶，将病毒复制酶多聚蛋白转化成功能蛋白[19]，而SARS-CoV-2进入宿主细胞主要依靠血管紧张素转换酶2(ACE2)受体[20]，因此，通过抑制SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受体有着重要的意义。从对接结合能和对接模式来看筛选的槲皮素、木犀草素、山奈酚化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2均有较好的结合，可能是化湿败毒方防治COVID-19主要物质基础。此外，槲皮素、木犀草素、山奈酚结合能与阳性对照药洛匹那韦、瑞德西韦、利托那韦均较接近，进一步证明化湿败毒方活性成分与3CL水解酶及ACE2受体具有良好结合活性。

为了探讨化湿败毒方治疗COVID-19分子机制，预测出的关键靶点有IL6、MAPK8、MAPK1、IL1B、RELA等。研究表明，IL6、IL1B在RT-PCR和Western blotting法检测中，H1N1感染组中IL6I、L1B表现上调[21]。MAPK8和MAPK1是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成员之一，它们在包括氧化应激、病毒感染等相关内环境应激下被激活[22]。RELA是NF-κB的家族成员之一，RELA在中性粒细胞的凋亡中发挥着重要的作用[23]。所以化湿败毒方可能调控这些细胞炎性因子以及相关趋化因子的活性，进而影响炎性反应。

从GO生物过程富集结果显示化湿败毒方治疗COVID-19，主要涉及炎症应答、氧化还原过程、免疫应答等生物过程，这些生物过程在化湿败毒方治疗COVID-19中起到了关键作用。KEGG通路富集主要涉及富集在卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、甲型流感、IL-17通路、TNF通路、AGE-RAGE通路等，其中卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、甲型流感等通路与COVID-19感染源相似，即病毒感染。而肿瘤坏死因子信号通路、白介素-17信号通路均是炎症反应中其重要作用的通路[24]。以上结果提示化湿败毒方可能通过抗病毒、抗炎、免疫调节等途径起到治疗COVID-19的作用。

综上所述，本研究基于现代药理学机制进行探讨，然后运用网络药理学方法预测化湿败毒方治疗COVID-19的作用机制研究，并借助分子对接技术进行靶点验证，揭示了化湿败毒方治疗COVID-19“多成分、多靶点、多通路”的特点，但是由于网络分析具有一定的局限性，对现阶段对本病发生、进展等机制机理的尚不清楚，仍然需要通过进一步的实验验证。