龙胆苦苷对大鼠肝纤维化Sonic Hedgehog信号通路的影响

李梓萌，周 僮，高 雅，徐 杰，连苑宇，冼红良，李迎迎，张可锋

桂林医学院，桂林 541004

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是由各类以肝细胞为靶点的慢性肝病所引起的，其中包括慢性病毒性肝炎、脂肪性肝炎和自身免疫性肝炎等[1]。HF与炎症反应和修复反应所致肝实质细胞和非实质细胞的变化有关，其中存在于肝窦周隙内的肝星状细胞(HSC)的活化是HF的关键因素，主要表现为α-平滑肌激动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表达增加，及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的大量分泌，特别是胶原蛋白的过度沉积，同时分化为成纤维细胞，引起纤维结缔组织的厚化与增生[2]。

龙胆苦苷(gentiopicroside，GPS)属于裂环烯醚萜苷类化合物，具有解热抗炎、镇痛、保肝、利胆、增强免疫和抗高血压等功效[3]。有研究表明GPS能减缓或逆转肝损伤、非酒精性脂肪肝、酒精性肝炎及肝内胆汁淤积等疾病，其机理主要与降低炎症反应、抑制氧化应激、调节血脂和增强机体免疫力有关[4,5]。

在纤维化过程中的一个重要特征是Sonic Hedgehog(Shh)信号通路的异常激活，Shh信号通路在胚胎发育中可调控细胞的增殖、分化，而在正常成熟组织中无表达，具有高度的保守性[6,7]。Shh信号通路可以调节成人肝脏组织中的伤口愈合反应，并且Shh信号通路对肝纤维化的促进作用与HSC的激活呈正相关，表明Shh信号可能是肝纤维化的潜在治疗靶标[8]。然而，目前尚无GPS对Shh信号传导途径作用的研究，因此本文旨在研究GPS能否通过抑制Shh信号通路从而发挥对肝脏的保护作用。

1 材料与试剂

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，共40只，体重180～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号:SCXK(湘)2016-0002，伦理委编号:GLMC201609026。

1.2 实验药物与试剂

龙胆苦苷药品(南京道斯夫生物科技有限公司，纯度>98%，批号：181116A)；分析纯CCl4(广东汕头市西陇化工厂)；秋水仙素(上海如吉生物科技发展有限公司，纯度>99%)；门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒(南京建成生物工程公司)；白蛋白(ALB)、总胆红素(TBIL)、透明质酸(HA)试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)；Ⅳ型胶原蛋白(Ⅳ-C)、Ⅲ型前胶原(PC Ⅲ)、层粘连蛋白(LN)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(南通市碧云天生物技术研究所)；PVDF膜(Bio-Rad公司，美国)；转化生长因子-β1(TGF-β1)抗体、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(Abcam，英国)；Shh蛋白抗体、Gli1蛋白抗体(赛默飞世尔科技有限公司)；β-actin抗体(天锡傲锐东源生物科技有限公司)；辣根酶标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Super ECL Plus超敏发光液(北京酷来博科技有限公司)。

1.3 仪器

THZ-C-1台式冷冻恒温振荡器(太仓市实验设备厂)；TGL-16K台式高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机厂)；Olympus BX51显微镜(奥林巴斯公司，日本)；Epoch酶标仪(Bio-tek公司，美国)；垂直电泳仪、转膜仪(Bio-Rad公司，美国)；上海天能全自动化学发光图像分析检测系统。

2 方法

2.1 造模及给药

将40只雄性SD大鼠适应性喂养1周后，随机分成4组，即正常组、模型组、秋水仙素(0.12 mg/kg)组及GPS(100 mg/kg)[4]组，每组10只。除正常组外，其余各组大鼠均每周腹腔注射两次40%的CCl4橄榄油溶液(1 mL/kg)，建立HF大鼠模型。除正常组和模型组大鼠灌胃相应体积(10 mL/kg)的生理盐水外，其余各组大鼠每天在固定时间灌胃相应体积(10 mL/kg)药物，持续6周。末次给药后，禁食不禁水，16 h后收集血液和肝组织。

2.2 实验大鼠情况观察

对大鼠的外观体征、行为活动、体重变化和肝脏的外观、形态进行观察记录。

2.3 肝组织病理学检测

取各组大鼠相同位置肝组织，用4%多聚甲醛水溶液固定，经包埋和切片处理后，分别进行苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色和Masson染色，并在光学显微镜下观察肝组织的病理改变。

2.4 肝组织免疫组化

肝组织切片置于70 ℃温箱中恒温30 min，再于二甲苯中脱蜡。用枸橼酸钠抗原修复液加热进行抗原修复，修复后切片冷却至室温。组织切片被依次加入过氧化氢和牛血清白蛋白。分别用一抗α-SMA和TGF-β1孵育1 h，二抗孵育1 h。最后，用DAB浸泡5 min着色，用苏木精复染，光学显微镜下观察结果并拍摄。

2.5 血清中相关指标测定

将所收集的血液于4 ℃条件下，4 500 rpm离心15 min后分离血清。采用生化法分别测定血清中ALT、AST、TBIL、ALB含量；采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)分别测定血清中HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ-C含量。上述指标的测定均严格按照检测试剂盒说明书操作，并采用酶标仪测定吸光度，根据标准曲线及公式分析计算ALT、AST、TBIL、ALB、HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ-C含量。

2.6 蛋白表达情况的测定

采用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定肝组织中TGF-β1、α-SMA、Shh及Gli l蛋白的表达水平。取各组大鼠肝组织约60 mg，置于玻璃匀浆器中，再加入含1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液1 mL，于冰上充分研磨。待组织完全裂解后，于4 ℃下，12 000 rpm离心10 min后取上清液，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书步骤对蛋白含量进行测定。加入蛋白样品缓冲液，并在95 ℃水浴中变性蛋白质20 min。将蛋白进行10% SDS-PAGE电泳，分离蛋白。于300 mA冰水浴条件下以恒流转膜2 h，5%脱脂牛奶封闭2 h，使用TBST洗涤3次，10 min/次。放入Ⅰ抗轻摇半小时后，于4 ℃下孵育过夜；次日，使用TBST同上洗涤3次，放入Ⅱ抗于室温下孵育1.5 h，使用TBST同上洗涤3次，采用ECL法显色，Tanon5 200全自动化学发光图像分析系统显影，以β-actin为内参，分析蛋白灰度并计算蛋白相对表达量。

2.7 数据统计学分析

32 结果与分析

3.1 GPS对HF大鼠状况的影响

正常组大鼠状态良好，活动灵敏，皮毛光泽，饮食和排便正常，体重明显增加。模型组大鼠精神明显萎靡，活动迟缓，皮毛无光泽度，食欲减退，排便清稀。与模型组比较，秋水仙素组和GPS组状况均明显改善，GPS组对HF大鼠状况改善效果更佳。

3.2 GPS对HF大鼠肝组织形态的影响

经肉眼观察，正常组大鼠肝组织色泽红润，表面光滑，边缘锐利。模型组肝组织颜色暗沉，无光泽，表面粗糙且伴有明显的颗粒，边缘钝化。与模型组比较，秋水仙素组和GPS组大鼠肝损伤病理特征均有不同程度的改善，且部分肝组织已恢复至正常(见图1)。

图1 GPS对HF大鼠肝脏形态的影响

图2 HE染色观察GPS对HF大鼠肝组织病理形态的影响(×200)

HE染色结果显示，正常组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐且生长情况正常，未见纤维组织增生。模型组大鼠肝小叶正常结构被破坏，大量肝细胞变性且坏死，伴有纤维组织增生和炎性细胞浸润现象，表明造模成功。与模型组相比较，秋水仙素组及GPS组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞坏死、纤维化及炎症程度均有所改善，表明GPS可改善大鼠肝纤维化(见图2)。

Masson染色结果显示，正常组的肝细胞结构完整，排列整齐，无蓝色胶原纤维沉积。模型组大鼠肝组织出现大量蓝色胶原纤维沉积，伴有肝细胞水肿，纤维化程度明显。与模型组相比较，秋水仙素组和GPS组大鼠肝组织病理损伤明显减轻，纤维化程度均有不同程度的改善(见图3)。

图3 Masson染色观察GPS对HF大鼠肝组织病理形态的影响(×200)

3.3 GPS对HF大鼠肝组织TGF-β1和α-SMA蛋白表达的影响

免疫组化结果显示，正常组中TGF-β1和α-SMA无明显表达。模型组TGF-β1和α-SMA表达增多，主要在受损肝细胞周围肝血窦和纤维间隔内表达。秋水仙素组和GPS组TGF-β1和α-SMA表达明显减弱，多在纤维增生处表达(见图4和5)。

图4 GPS对HF大鼠肝组织TGF-β1表达的影响(×200)

图5 GPS对HF大鼠肝组织α-SMA表达的影响(×200)

3.4 GPS对HF大鼠血清ALT、AST、TBIL和ALB的影响

模型组大鼠血清ALT、AST、TBIL水平较正常组大鼠均显著升高，ALB水平显著降低，差异均具有统计学意义(P<0.01)。GPS组大鼠血清ALT、AST、TBIL水平较模型组均显著下降，ALB水平显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.01)(见表1)。

3.5 GPS对HF大鼠血清HA、LN、PC Ⅲ和Ⅳ-C的影响

模型组大鼠血清中LN、HA、PC Ⅲ和Ⅳ-C含量较正常组大鼠均显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.01)，说明本实验造模成功。GPS组大鼠血清中HA，LN，PC Ⅲ和Ⅳ-C含量较模型组大鼠均显著降低，差异均具有统计学意义(P<0.01)，此结果表明GPS对CCl4所造成的肝损伤具有保护作用(见表2)。

表1 GPS对血清中ALT、AST、TBIL和ALB的影响

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；下同。

Note:Compared with normal group,##P<0.01;Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01;The same below.

表2 GPS对血清中HA、LN、PC Ⅲ和Ⅳ-C的影响

3.6 GPS对HF大鼠肝组织TGF-β1、α-SMA、Shh及Gli l蛋白表达的影响

模型组大鼠肝组织中TGF-β1、α-SMA、Shh及Gli l蛋白表达量较正常组大鼠均显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.01)；GPS组较模型组大鼠可明显抑制TGF-β1、α-SMA、Shh及Gli l表达，差异均具有统计学意义(P<0.01)，此结果表明GPS抗肝纤维化可能与Shh信号通路有关(见图6)。

图6 GPS对TGF-β1、α-SMA、Shh及Gli l蛋白表达的影响

4 结论

肝纤维化是机体肝脏受损时的自我修复反应，是可逆的病变过程，但当各种因素造成肝损伤不能得到及时缓解时，可最终发展为不可逆的肝硬化，对人体造成巨大危害[9,10]。而目前肝脏疾病在我国具有较高的发病率和致死率，因此，研究GPS对肝脏的保护作用具有重要意义[11]。

本实验采用CCl4造模，CCl4为经典的HF诱导剂，所建立的大鼠HF模型与人体HF的病理学改变极为相似[12]。CCl4造成肝损伤的机制是破坏肝细胞膜的完整性，使其通透性增加，导致肝细胞内AST、ALT进入血清，可通过测定血清中AST、ALT含量来观察肝脏受损程度[13,14]。与此同时，肝细胞的排泄功能降低，导致胆红素的排出发生障碍，使血清中TBIL水平显著增高，因此通过测定血清中TBIL水平可反映肝脏的分泌、排泄和解毒功能[15]。合成ALB是肝脏的特有功能，CCl4诱导生成HF后肝脏合成功能发生障碍，使血清中ALB水平显著下降[16]。HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ-C是肝细胞外基质的主要成分，肝损伤时可导致其合成大于降解，导致过多沉积于肝组织中，诱发HF，因此ECM含量高低可反映HF程度[17]。在本研究中，模型组大鼠血清中AST、ALT、TBIL、HA、LN、PC III及IV-C含量显著升高，ALB含量显著下降，且经HE染色和Masson染色后，可明显观察到肝组织病理切片中模型组大鼠肝损伤较为严重，具有明显HF的特征，提示CCl4造模成功。GPS给药后，大鼠血清中AST、ALT、HA、LN、PC III及IV-C含量显著降低，ALB含量显著上升，HF染色结果病变程度改善，可推测GPS对CCl4诱导的HF大鼠具有保护作用。

TGF-β1是促进HF的主要因子，可通过上调HSC而合成大量的ECM，加速肝纤维化，TGF-β1的表达与肝纤维化程度成正相关[18]。α-SMA可反映HSC的活化情况，作为HSC激活的标志性蛋白，同时也可用于评估肝纤维化程度[19]。实验结果显示，模型组大鼠肝组织TGF-β1和α-SMA的蛋白表达水平显著提高；采用GPS给药后，大鼠肝组织TGF-β1和α-SMA的蛋白表达水平较模型组显著降低。此结果表明GPS可通过抑制TGF-β1蛋白表达而发挥抗HF作用。

Shh在多种癌症的发生和发展中起着至关重要的作用，Shh异常激活会诱导细胞过度增殖和恶性改变[20]。Shh信号通路主要由Shh配体、两个跨膜蛋白受体(Smo、Ptch)及下游转录因子Gli家族(Gli 1、Gli 2、Gli 3)等组成，Shh配体与Smo受体是该信号通路的激动因子，Ptch受体是该信号通路的抑制因子，其中Gli 1是Shh通路重要的效应基因，且Gli 1的活化是Shh信号通路激活的重要标志[21]。Shh与Ptch结合后导致Ptch对Smo的抑制作用解除，在细胞核中Smo可诱导转录因子Gli家族的激活，HSC活化时，胞内有Shh配体表达，可激活Shh信号通路促使HSC增殖[22]。因此，抑制Shh信号的激活将有助于抑制HF。实验结果显示，模型组大鼠肝组织Shh和Gli l的蛋白表达水平显著提高；采用GPS给药后，大鼠肝组织Shh和 Gli l的蛋白表达水平较模型组显著降低。此结果表明GPS可通过抑制Shh信号通路而发挥抗HF作用。综上表明，GPS对肝纤维化具有保护作用，其机制可能与抑制Shh信号通路有关。