枫香脂干预类风湿关节炎机制的分子对接研究

满 达，白明慧，木其尔，呼格吉乐，秀布松，黄树青，特木其乐

1内蒙古自治区国际蒙医医院治未病中心；2内蒙古自治区国际蒙医医院急诊科；3内蒙古自治区国际蒙医医院点穴科；4内蒙古自治区国际蒙医医院脑病中心，呼和浩特市 010020

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种累及周围关节的多系统、炎症性的自身免疫性疾病，其病理特征为关节滑膜慢性炎症，侵犯下层软骨造成关节破坏，全世界每年的发病率大约1%～3%[1]。RA使患者承受长期的疼痛，致残率高，严重影响生活质量。其病因主要有遗传、感染、内分泌及寒冷、潮湿、疲劳外伤等。西药治疗RA的作用机制明确，但作用效果单一，其副作用多，需要和其他药物联合使用效果更佳。蒙医上RA属于托列病的范畴，根据文献记载托列病分为齐素协日型、巴达干赫依型及协日乌素型3个证型。临床上蒙药对RA治疗作用良好，副作用小，有着很大的研究空间。

枫香脂，又称“白云香”、“查干古古勒”、“伯依嘎日”，为金缕梅科植物枫香树(LiquidambarformosanaHance)的干燥树脂。蒙医学认为白云香味苦、辛，性凉、燥、轻、锐；有燥脓及黄水，消肿，疗伤，止痛，解毒之功效。临床主要应用于痛风、痹病、黄水病(包含托列病)、关节疼痛、疥癣、秃疮、白癜风、皮肤瘙痒等皮肤病及咽喉肿痛、乳腺炎等，是蒙医临床上应用较广的药物之一。现代研究发现，枫香脂有效活性成分有(+)-2-bornanone、ethyl iso-allocholate、α-terpineol等13种，具有抗菌、杀虫止痒、消肿止痛的功效[2]。枫香脂一直广泛应用于治疗RA的蒙医方剂中，如枫香脂十五味丸、云香十五味丸、风湿二十五味丸、孟根乌苏-18等治疗RA的方剂中均有枫香脂。由于枫香脂含有多种活性成分多[3]，其治疗RA作用靶点及机制尚不完全明确，若按传统的提取分离到活性测定，时间长、难度大。

网络药理学由英国药理学家Hopkins在2007年提出，是基于系统生物学理论，运用各种组学、高通量筛选、网络分析等技术揭示“药物-靶点-疾病”间的复杂网络关系，打破既往单成分-单靶点-单疾病的研究模式，对预测中药多成分、多靶点、多途径的作用机制具有重要意义[4]。网络药理学是中药、蒙药研究领域最常见的技术之一。例如，Liang等[5]基于网络药理学系统揭示了新天泰1号通过多成分-多靶点-多途径综合调控阿尔茨海默病的物质基础和生物学机制，Li等[6]基于网络药理学探讨了全石榴“助胃火”治疗功能性胃肠病的作用机制，Man等[7]通过计算机辅助的数据挖掘以及药理学方法，预测探讨蒙药治疗萨病的作用机制。

在此背景下，本次研究基于网络药理学方法与分子对接，对枫香脂有效活性成分治疗RA的作用机制进行研究，初步阐明其多成分-多靶点-多通路协同的作用机制，为后期进行生物学验证提供理论依据和研究方向。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件

TCMID数据库(http://www.megabionet.org/tcmid/)、TCM-ID数据库(https://bigd.big.ac.cn/databasecommons/database/id/3017)为用于查询药物全部成分数据库；SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测小分子靶点；TTD数据库(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)、NHGRI(https://www.genome.gov/)、GWAS(Genome-wide association analysis)进行疾病靶标预测；STRING在线数据库(https://stringdb.org/)中获取蛋白互作网络数据；Metascape平台(http://metascape.org)进行富集分析；Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)进行蛋白名称、格式矫正。

Gephi软件(下载地址https://gephi.org/)构建“成份-靶点”互作用网络图和蛋白互作用网络图；LeDock(http://lephar.com/)为基于网络药理学的预测和分析分子对接软件。

1.2 方法

1.2.1 枫香脂的成分来源

以“枫香脂”为关键词，从TCMID、TCM-ID平台及相关文献查询枫香脂的全部成分，利用SwissADME数据库，筛选出化合物的“GI absorption”(该数据中口服生物利用度的评价指标)标记为“High”，同时“LiBinski”(该数据库中类药性指数的评价指标)标记为“Yes”的活性成分。

1.2.2 活性成分作用靶点及RA作用靶点的获取

将上一步骤中得到的药物活性成分以smile格式逐一输入SwissTargetPrediction数据库，以物种“homo sapiens”为筛选条件，检索到相应的靶点，选取“probability”大于零的作用靶点。

从TTD、NHGRI、GWAS等数据库查找RA相关靶点，将各活性成分靶点与RA相关靶点进行比对，筛选出的共同靶点即为枫香脂治疗RA的靶点。

1.2.3 “成分-靶标”网络构建

将“1.2.1”项筛选出的枫香脂活性成分和“1.2.2”项得到的治疗RA的靶点导入Gephi 软件中，构建枫香脂的“成分-靶点”网络。

1.2.4 靶点相互作用网络构建

通过数据库String获取枫香脂活性分子与RA相关靶标的相互关系，并将数据导入软件Gephi中构建靶标间相互作用网络，将节点设置为不同大小和颜色，用于反映degree值(连接度，即在网络中通过该点的边的个数)的大小。

1.2.5 信号通路富集分析

通过上述步骤取得关键靶点后，应用Metascape平台(http://metascape.org)进行信号通路富集分析，可视化展现主要信号通路，进一步分析枫香脂治疗RA的可能作用机制。Metascape平台是一个基因注释分析数据库，不仅能提供全面的功能注释，而且拥有数据库更新及时、使用免费、操作简便等特点。Metascape有去除冗余的功能，把功能相近的通路合成一个簇，显示更直观、清晰。将枫香脂治疗RA的预测疾病共有靶点导入Metascape，设置物种为人，进行生物过程、通路分析，根据靶点数目的多少对结果进行排序，保留排名靠前的结果。

1.2.6 活性成分与相关靶点的分子对接

分子对接通过预测出受体和配体的结合构象和亲和力来进行小分子改造和设计，由此获得药物开发的依据。2016年，Hou等[8]对常用的10种分子对接软件进行对比后，发现LeDock对2 002个蛋白配体复合物的对接进行评估时有明显的优势。LeDocK是由赵洪涛研发的分子对接软件，它在ASTEX多样性集上实现了超过90%的姿势预测精度。因此，本次分子对接软件选用了LeDock分子对接软件。利用Uniprot PDB数据库查找枫香脂作用于RA靶点的PDB格式，将mol2格式的枫香脂有效活性成分与PDB格式形式的靶点导入Ledock进行分子对接，通过所得Docking Score值分析对接分子与靶点之间的结合活性，分值越高说明分子与靶点的结合越牢固，并将对接结果以热图形式呈现。

2 结果

2.1 枫香脂的活性成分

TCMID、TCM-ID平台及相关文献记载，枫香脂化学成分有35种。临床应用的枫香脂为阴干，而阴干的枫香脂样品中不含(Z，Z)-2，5-十五烯醇[9]，故本次研究中去掉(Z，Z)-2，5-十五烯醇。根据口服生物利用度和类药性指数筛选后符合标准有效活性成分有13种(见表1)。

表1 枫香脂的主要活性成分

2.2 活性成分作用靶点及RA作用靶点的获取

从SwissTargetPrediction数据库中得到与枫香脂活性成分相对应的靶点共479个，去重后288个，获取116个RA疾病靶点，共同靶点27个，与这些靶点相对应的枫香脂的成分共8个(见表2)。

2.3 “成分-靶点”网络构建

将枫香脂化学成分和枫香脂治疗RA的靶点导入Gephi软件，构建的“成分-靶点”网络(图1)，图中含有35个节点，185条边线。边线代表活性成分与潜在靶标的相互关联。可见，一种活性成分可以作用于多个靶点，同时多种成分也可作用于同一靶点。

2.4 靶点间相互作用网络的构建

将枫香脂活性成分治疗RA的27个靶点导入String数据库获取靶点间的相互作用关系，以excel格式下载靶点相互作用关系。将靶点相互作用邻接表输入Gephi软件中，构建靶点间相互作用网络(图2)，其中包含18个节点，36条边线。图2中，圆形节点代表靶点，边线代表靶标之间的相关性，节点面积的大小表示靶点的“度”值大小，节点面积越大，表示其“度”值越大。由图可见，枫香脂治疗RA的作用机制主要与JAK1、JAK3、MAPK14、PTGS2、PTPN11、PTPN2等靶点相关。

表2 枫香脂活性成分治疗RA的靶点

图1 枫香脂“成分-靶点”网络

图2 枫香脂-类风湿靶点互作用网络

图3 基于Metascape的富集分析

2.5 生物学功能与信号通路分析-富集分析

将枫香脂活性成分靶点中治疗RA的27个靶点导入Metascape平台，物种选为“sapiens”，进行“custom analysis”，显示枫香脂治疗RA的靶标显著富集于白介素-2通路、细胞因子的产生、白介素信号、钙离子运输的调节、白细胞介素对氮化合物的反应、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节等通路及生物过程(图3)。Metascape有去除冗余的功能，把功能相近的通路合成一个簇，展开分析包还发现白介素-6相关的信号通路、MAPK信号通路等主要信号通路包含在蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节簇里面。

2.6 分子对接

将mol2格式的M6、M8、M19、M23等4个主要活性成分和PDB格式的MAPK14、CTSK、G6PD、PTGS2等4个最重要的靶点，导入LeDock进行分子对接，同时将对接结果绘制成热图(图4)，其中E64、SA、SB2、NAP分别是MAPK14、CTSK、G6PD、PTGS2等四个复合物中的配体。部分分子对接情况见图5～8，图5和图6为分子对接3D展示图，图7和图8为2D展示图。由于PTPN2等靶点尚没有配体结合结构，所以为提高对接结果的可靠性，本次只选择了已有配体结合结构的靶点进行分子对接验证。

3 讨论

本研究对获取的13种具有相关生物活性的化学成分进行分析，发现大多成分有抗菌、抗炎及止痛作用。(+)-2-bornanone具有杀虫止痒、消肿止痛的功效[2]，ethyl iso-allocholate具有抗菌、抗炎活性[10]，terpinen-4-ol及其衍生物具有多种优良的生物活性，如杀虫、杀螨、抗菌、抗癌、抗炎等[11]，α-terpineol的药理活性主要有抗菌活性[12]、抗痉挛作用[13]、抗炎作用[14]。某些细菌或病毒可能借助菌体蛋白与RA病人自身蛋白的交叉免疫反应而致病[2]。故上述活性成分可能通过抑菌、抗炎、止痛作用参与对RA的治疗。

图4 热图

图5 M8、M19与CTSK、G6PD、MAPK14在活性口袋内的姿态

图6 M6、M19、M23与MAPK14、PTGS2在活性口袋内的姿态

图7 M8、M19与CTSK、G6PD、MAPK14互作用的二维示意图

图8 M6、M19、M23与MAPK14、PTGS2互作用的二维示意图

根据成分-靶点网络与靶点相互作用网络显示的27个治疗RA的靶点中，PLA2G1B、CTSK、MAPK14、G6PD、PTGS2等靶点与炎症相关。Pla2g1b为疼痛反应调节相关基因[15]。前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)也被称为COX-2，是前列腺素生物合成中的关键酶，在炎症反应中发挥重要作用[16]。此外，G6PD是糖酵解途径的关键酶，糖酵解活性的上调可导致RA患者关节滑膜增生、血管翳形成，加剧炎症和骨质破坏，抑制糖酵解可以缓解滑膜细胞的炎症反应[17]。由此推论，枫香脂经调控G6PD参与糖酵解过程，缓解滑膜细胞的炎症反应，从而对RA起到治疗作用。

富集分析结果显示，枫香脂可通过多种通路、生物过程发挥治疗RA的作用。有研究发现，IL-6也是RA关节损伤中的主要介质之一，在骨质破坏中也发挥重要作用。IL-6主要是由活化的单核细胞产生，可诱导 IL-17、IL-1、IL-2等其他炎性细胞因子的产生和释放，并加强其炎症破坏作用，同时诱导B淋巴细胞合成和分泌免疫球蛋白、类风湿因子[18]。另外，MAPK主要由细胞外信号调节激酶、c-Jun氨基末端激酶(jun N-terminal kinase，JNK)、p38组成，在破骨细胞分化和存活中有重要意义。MAPK的几条信号途径在RA滑膜细胞中交叉起作用，并启动基因转录，产生一系列炎性细胞因子、基质蛋白降解酶等刺激滑膜细胞增生，衬里层增厚及关节软骨和骨组织的破坏，最终导致关节畸形[19]。CD4+T细胞介导的自身免疫反应在类风湿关节炎的发病过程中作用显著。目前的研究普遍认为，CD4+T细胞可分为Thl及Th2两种亚群，IL-2主要由CD4+T细胞的Thl亚群分泌，一旦机体发生Thl或Th2细胞占优势时，可导致发生RA。也有文献报道，若类风湿关节炎患者血清中IL-2水平升高,说明其血清中SB7-H3水平亦发生异常，从而使T细胞活化过度，最终导致分泌IL-2，从而影响类风湿关节炎的发生发展[20]。

将有效活性成分与参与度较高的靶点进行分子对接后显示，M19与CTSK、G6PD、MAPK14、PTGS2，M8与G6PD、MAPK14，M6与PTGS2，M23与PTGS2配对评分较高，易于形成稳定的结合构象。提示这些成分在治疗RA中具有重要作用，可作为未来枫香脂成分提取用于治疗RA的研究对象。本研究单纯从网络药理学角度来认识和了解枫香脂治疗类风湿关节炎的作用机制，未能将网络药理学与动物/细胞实验相结合，接下来还要对网络药理学所得结果与结论进行后续的实验验证。

本研究通过网络药理学研究、分子对接，阐述了枫香脂活性成分主要作用靶点以及相互作用途径的特点。通过分析发现，枫香脂的(+)-2-bornanone、ethyl iso-allocholate、α-terpineol等13种成分通过PLA2G1B、MAPK14、CTSK、G6PD、PTGS2等靶点及白介素-2、白介素-6、MAPK等信号通路发挥作用。枫香脂对RA的治疗体现了蒙药多成分、多靶点、多途径的特点，也符合多靶点联合药物治疗RA的未来趋势。最后，本次研究通过分子对接验证了网络药理学数据的可靠性，对后续深入研究枫香脂治疗RA的分子机制奠定了基础。