脱落乳牙牙髓干细胞治疗大鼠脊髓损伤的实验研究

刘露 翟启明 张青 刘安琪 刘文佳 金钫

脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)取自人类自然更替的乳牙牙髓，具有高度增殖能力；且来源于神经嵴的外胚间充质，又具有胚胎早期间充质干细胞的优良性能，是组织工程技术中理想的种子细胞[1-2]。SHED具有多向分化能力，可以成牙本质，成牙髓、成骨、成脂、成神经甚至成肝细胞分化等[1]；有广泛的应用前景，如常用于牙髓牙周再生[3]、颅骨颌骨缺损[4]及皮肤损伤[5]等的治疗，更因其为神经嵴来源，在神经损伤修复方面具有独特的优势，也可用于神经系统疾病的治疗[6-7]。脊髓属于中枢神经系统的一部分，脊髓损伤后可引起不同节段的瘫痪，给患者和家人带来极大痛苦，因此对它的治疗意义重大；然而目前临床上对脊髓损伤尚无有效疗法[8]，对此探究任重道远。

本实验室在前期研究中已初步证实SHED聚合体有可能成为治疗大鼠脊髓损伤的新疗法，且SHED聚合体的疗效要优于UCMSCs聚合体[9]；本研究想通过联合治疗来进行疗效优化，探究基于SHED聚合体的治疗大鼠脊髓损伤的更优疗法。大量实验研究中应用干细胞悬液显微注射，创造有利于脊髓损伤恢复的微环境进行治疗[10-11]。考虑到在脊髓损伤区植入的SHED聚合体也需要有利于其存活及发挥作用的微环境，且SHED在细胞来源、神经营养因子、细胞因子分泌及免疫调节等方面具有很大优势[12]，猜想联合SHED细胞悬液注射或许能最大限度地激发SHED对脊髓损伤的修复潜能。因此，本实验拟探究联合SHED细胞悬液注射是否能有效提高SHED聚合体治疗大鼠脊髓损伤的疗效。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

α-MEM培养基(Gibco,美国)； 胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程材料有限公司)； 胶原酶、维生素C、 1%戊巴比妥钠， 4%多聚甲醛， TritonX-100(Sigma,美国)； GFAP抗体、NF抗体(CellSignalingTechnology, 美国)； MBP抗体、HuNu抗体、Fluor488二抗(Abcam, 英国)； Cy3IgG二抗(Jackson,美国)； BDNF、NT-3、NGF的ELISA检测试剂盒(R&D Systems,美国)； Hamilton微量注射器(Hamilton， 5 μl，瑞士)； WPI显微注射系统(武汉微科精密仪器有限公司)； EndeavorCR术中脊髓监护仪(广州尼高力科学仪器公司)； 冰冻切片机(Leica，德国)； 激光共聚焦显微镜(Olympus，日本)。

1.2 实验动物

健康雌性SD大鼠28 只(180～200 g)，由第四军医大学动物实验中心提供，动物实验程序符合本校动物使用及管理委员会规定。

1.3 SHED聚合体的培养

将P5代SHED以3×105个/孔的密度接种于12 孔板中，细胞融合率达85%左右时弃去原培养液，换成含VC(50 μg/ml)的α-MEM培养液，隔天换液，培养7 d左右即可形成聚合体(具体方法参见已发表文章[9])。聚合体培养成熟后立即进行体内移植治疗。

1.4 SHED细胞悬液的制备

选用P5代SHED，接种至培养皿，当细胞融合率约达90%时，消化离心重悬，调成细胞浓度为1×105个/μl的细胞悬液。

1.5 大鼠全横断脊髓损伤模型建立及分组治疗

建模：去除大鼠T8、T9椎板，在暴露的T8-9脊髓的中间部位用显微剪进行全横断损伤，之后均匀剪除一段脊髓组织，形成2 mm间隙。脊髓全横断后大鼠后肢瘫痪。

治疗：间隙内可植入SHED聚合体。损伤脊髓的两断端可联合SHED悬液注射，注射位点：距损伤断端约2～3 mm,中线两侧各2 mm处进针，注射深度1.5 mm,每个位点注射2.5 μl(1×105个/μl)。

实验分组: ① SHAM组(n=6)：仅去除T8、T9椎板； ② SCI only组(n=6)：仅建模不治疗； ③ SHED-CA组(n=8)：建模后，在2 mm间隙内移植SHED聚合体治疗并在其表面用纤维蛋白胶覆盖； ④ SHED-CA+SHED组(n=8)：建模后，在2 mm间隙内移植SHED聚合体且表面覆盖纤维蛋白胶，并在脊髓损伤两断端联合SHED悬液注射治疗。

1.6 SHED治疗大鼠全横断脊髓损伤的观察指标

1.6.1 行为学评分(BBB评分) 术后每周进行BBB评分检测，观察大鼠后肢运动功能的恢复情况。将大鼠逐只放至开放场地中，每只5 min，根据BBB评分标准由至少两名实验员进行盲评。 0 分为完全瘫痪， 21 分为正常。

1.6.2 大鼠脊髓组织免疫荧光染色 第12周末，大鼠心脏灌注后，取损伤区脊髓组织包埋做冰冻切片，并对GFAP、MBP、NF等神经源性标志物进行免疫荧光染色。加入一抗过夜后，加入荧光二抗避光孵育，染核，封片，于激光共聚焦显微镜下观察拍照。所用一抗：GFAP(兔源)1∶300，MBP(兔源)1∶1 000， NF(兔源)1∶1 000，HuNu(小鼠来源) 1∶500； 二抗：Fluor488(驴抗兔)1∶800， Cy3IgG(羊抗小鼠)1∶300。

1.6.3 脊髓损伤后BDNF、NT-3、NGF分泌的ELISA检测 分别于第1、 4和12 周结束时各组随机选取1 只大鼠，用生理盐水心脏灌注后迅速从脊髓损伤区取出长约2 cm的脊髓组织，用匀浆器及RIPA裂解液制备脊髓组织匀浆，提取上清液进行ELISA检测(具体检测方法参见试剂盒说明书)。

1.7 统计学分析

实验数据采用GraphPad Prism和SPSS 23.0软件进行统计分析，两独立样本均数比较采用t检验，多样本均数比较采用ANOVA方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 BBB评分

大鼠全横断脊髓损伤后，双后肢完全瘫痪。SCI only组未进行治疗，BBB评分前3 周基本为0，之后有一定恢复但最高不超过3 分。SHED-CA组和SHED-CA+SHED组与SCI only组比，后肢运动功能均有明显恢复，分别于第7 周、 第10 周进入平台期；且从第4 周起联合SHED悬液注射组的疗效要好于单纯SHED聚合体治疗组，至第9～12 周时有明显统计学差异(P<0.05)(图 1)。

2.2 脊髓组织免疫荧光染色结果

GFAP(图 2)：星形胶质细胞标记物，脊髓损伤后参与瘢痕组织形成，而瘢痕组织会阻碍轴突再生。SCI only组出现大量阳性标记，而SHED-CA组仅有极少量阳性标记，SHED-CA+SHED组则几乎无阳性标记。表明：SHED-CA可有效减少瘢痕形成，且联合SHED悬液注射后能更好地抑制瘢痕形成。GFAP与移植细胞HuNu共定位结果显示阴性，表明：所移植的SHED细胞没有出现向星形胶质细胞的分化。

图 1 大鼠后肢运动功能BBB评分(*:P<0.05)

Fig 1 BBB scores of the locomotor function of rats' hind limbs(*:P<0.05)

MBP(图 3)：髓鞘即少突胶质细胞的标记物，主要分布于细胞浆膜面。脊髓损伤后髓鞘细胞多坏死、凋亡，相应的SCI only组几乎无阳性标记。SHED-CA+SHED组有较多明显的阳性标记，而SHED-CA组仅有少量阳性标记，表明：SHED聚合体联合SHED悬液注射比单纯SHED聚合体治疗有更好的髓鞘保护作用或能再生修复髓鞘损伤。且SHED-CA+SHED组与移植细胞标记HuNu共定位显示有极少量阳性，说明：SHED聚合体治疗可能促进了内源性髓鞘细胞再生，其自身并没有出现向髓鞘细胞的直接分化，但联合SHED悬液注射可能有助于SHED分化为髓鞘细胞。

图2 GFAP与HuNu免疫荧光共染 (左：×10， 右：×200)

Fig 2 GFAP and HuNu co-staining with immunofluorescence staining (Left: ×10; Right: ×200)

图3 MBP与HuNu免疫荧光共染 (左：×10， 右：×200)

Fig 3 MBP and HuNu co-staining with immunofluorescence staining (Left: ×10， Right: ×200)

NF(图4)：神经纤维标记物，呈丝线状分布。脊髓损伤后大量神经纤维坏死、凋亡，SCI only组几乎无阳性标记。经治疗后，SHED-CA+SHED组有较多明显的阳性标记，SHED-CA组有少量阳性标记，说明：SHED聚合体联合SHED悬液注射对神经纤维的修复效果更好。但与移植细胞HuNu共定位结果显示阴性，表明：SHED可能并不是通过直接分化成神经元而发挥作用，可能促进了固有脊髓神经元的内源性再生。

2.3 脊髓损伤后BDNF、NT-3、NGF分泌的ELISA检测结果

神经营养因子的存在对脊髓损伤修复、轴突生长及再生、突触形成及重组等起着关键性作用。脊髓损伤后BDNF、NT-3、NGF这3 种神经营养因子的分泌量在1 周以内有少量增加，随后迅速减少， 4 周后即降到较低水平；而用SHED进行治疗后，有效促进了它们的分泌，且SHED聚合体联合SHED悬液注射的效果更好：相同时间点SHED-CA+SHED组分泌量一直是最多的，且在第12 周时与SHED-CA组比有统计学差异(P<0.05)；虽然4 周后它们的分泌量均逐渐减少，但联合SHED悬液注射组降低幅度更小。

3 讨 论

有实验已证明SHED可有效修复脊髓损伤，使其有较好的功能恢复，他们采用的是SHED细胞悬液注射治疗，或SHED复合外源性支架材料的组织工程方法治疗[13-14]；而本课题组创新性地发现SHED聚合体治疗脊髓损伤更是有不错疗效[9]； 并且为探究基于SHED聚合体的具有更佳疗效的疗法，本实验采用联合治疗的方法进行研究。考虑到不同的移植途径可能发挥不同的作用：悬液注射治疗的细胞更容易迁徙及分泌各种因子，可能对局部微环境的调控起到作用；而聚合体更好地保存了细胞间天然分子连接及物理、化学、生物信息，有利于细胞间信号传递并行使功能；故本实验采用联合SHED悬液注射的方法来探究能否提高SHED聚合体的疗效。

本研究动物实验结果显示：BBB评分发现联合SHED悬液注射可有效提高SHED聚合体治疗大鼠脊髓损伤的疗效，第4周之后逐渐明显，尤其第9～12 周有显著统计学差异，最高评分达12 分，也高于同类研究中的BBB评分值(8 分)[9,14]。免疫荧光染色结果显示与单纯SHED聚合体治疗组相比，联合SHED悬液注射可更好地抑制瘢痕组织形成，并使髓鞘及神经纤维出现再生修复；且与HuNu共定位结果显示联合SHED悬液注射有助于SHED分化为髓鞘细胞，促进神经纤维再髓鞘化。同时神经营养因子分泌的检测结果显示SHED聚合体治疗可明显增加BDNF、NT-3、NGF的分泌，且联合SHED悬液注射增加量更多。BDNF、NT-3主要可增加运动神经元的存活，而NGF对早期感觉功能的发育及存活作用较大[15]，这也与本研究关注的大鼠运动与感觉功能有明显恢复这一现象相契合。

图4 NF与HuNu免疫荧光共染 (左：×10， 右：×200)

Fig 4 NF and HuNu co-staining with immunofluorescence staining (Left:×10， Right:×200)

图 5 术后第1、 4、 12 周BDNF、 NT-3、 NGF分泌的ELISA检测

Fig 5 BDNF, NT-3 and NGF secretion detected by ELISA at 1， 4 and 12 weeks after operation

最终本研究得出初步结论：联合SHED悬液注射能明显提高SHED聚合体治疗大鼠脊髓损伤的疗效。本研究采用早期的SHED细胞，并在诱导成聚合体时采用高浓度培养，以减少体外培养时间，尽量保持其神经嵴来源的特性；之后未经成神经诱导而直接植入脊髓损伤后的环境中，使其得到自然诱导。同时在脊髓损伤断端联合SHED悬液注射，使其分泌的多种因子能有效调节局部微环境，促进轴突再生。本研究推测，有如此好的疗效是因为：SHED悬液注射促进分泌更多的神经营养因子，创造有利于脊髓损伤恢复的微环境，除了促进内源性脊髓再生，SHED自身也向髓鞘细胞方向分化，从而重建神经传导通路，使得运动和感觉功能有明显恢复。

本实验通过联合SHED悬液注射的方式，探究到了基于SHED聚合体的治疗大鼠脊髓损伤的更为有效的疗法，充分探究了SHED在中枢神经损伤修复方面的应用，也为临床治疗脊髓损又提供一条新思路。本研究发现SHED可能通过向髓鞘细胞分化及旁分泌机制创造有利于脊髓损伤恢复的微环境而发挥作用，不过具体机制还有待深入讨论。而且实验动物与人类实际情况相差还很大，仍需要大量工作去探究此方法在更高级动物甚至人体上的可行性及有效性。