一种新型弹性仿生人工血管修复大鼠血管缺损的应用研究

2020-07-08张晏源黄鑫吕前欣侯燕靳丹高晔刘富伟蔡卜磊孔亮

实用口腔医学杂志 2020年3期

张晏源黄鑫吕前欣侯燕靳丹高晔刘富伟蔡卜磊孔亮

血管移植常用于口腔颌面部创伤后组织修复重建，自体血管移植是血运重建的“金标准”，但使用自体血管会造成供区损伤，且个体也无法提供足够的血管量来满足临床需求[1-2]。因此人工血管替代自体血管已成为趋势。目前人工血管虽然已被用于临床，但常因动脉瘤、动脉破裂、血管内膜过度增生等情况导致移植失败。其主要原因是人工血管力学性能低和生物学性能差[3]。

本研究利用静电纺丝技术，使用PCL和PU逐层构建弹性仿生人工血管，内层、外层均采用PCL微纳米纺丝提高生物学性能[4]，中层采用PCL/PU(W/W, 1/3) 微纳米纺丝增强力学性能，提高血管弹性[5]。随后，构建SD大鼠腹主动脉缺损模型，并使用该PCL/PU血管修复缺损，并检测其在体内的血管重建效果，为PCL/PU血管的临床应用提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 PCL/PU血管构建

聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU, Sigma-Aldrich, 美国)；二氯甲烷(DCM)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)(北京化学试剂有限公司)。采用静电纺丝，层层组装制备PCL/PU血管，接收纺丝的为直径2 mm的金属滚轴，滚轴匀速转动，使纺丝均匀缠绕并逐渐增厚，内层为PCL微纳米纤维，中层为PCL/PU(W/W，1/3)混合微纳米纤维，外层为PCL微纳米纤维，连续纺丝至形成PCL/PU血管，成通风干燥，备用。

1.2 大鼠腹主动脉与PCL/PU血管微观结构比较

扫描电镜(SEM)(Hitachi, S-4800, 日本)观察，大鼠腹主动脉与PCL/PU血管分别剪裁出长度0.5 cm，戊二醛固定24 h后，梯度乙醇脱水，无水乙醇脱水2次，加入锇酸，干燥，喷金，SEM观察。

1.3 爆破压力测试

将PCL/PU血管(4 cm)固定至爆破压测量仪上，在管腔内注入蒸馏水，一端连接电子气压计，另一端连接气瓶，逐渐增加PCL/PU血管管腔内压力，并记录压力值，直至PCL/PU血管发生渗漏。

1.4 模量测试

获取大鼠腹主动脉和PCL/PU血管，利用万能力学仪(BOSE 3220,美国)测量，设定拉升速度为1 cm/min，重复测量5 次。

1.5 动物模型建立

选取200～230 g， 8 周龄 SD雄性大鼠10 只，第四军医大学实验动物中心提供。采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(0.167 g/100 g)，腹正中切口，用湿棉棒轻柔推开肠道，暴露腹主动脉，夹闭腹主动，剪断并用肝素钠冲洗管腔，使用8-0缝线在显微镜下操作缝合，建立SD大鼠腹主动脉移植PCL/PU血管模型，术前、术后均不使用任何抗凝药物，并在1 个月后进行取材。

1.6 组织学切片制作

取材后，用PBS冲洗组织，OCT包埋，在-20 ℃下冷冻切片厚度为7 μm，然后进行HE染色、Masson染色，并于正置显微镜下拍摄记录。免疫荧光染色采用CD31(R&D)、 α-SMA(Abcam)， BSA封闭， 4 ℃孵育过夜，Fluor594(CST)避光孵育1 h，封片，激光共聚焦显微镜(CLM, OLYMPUS, FV1000, 日本)下拍摄记录。

2 结果

2.1 血管断面观察对比

SEM显示大鼠腹主动脉(n=5)厚度约为(180±32) μm，呈现典型三层结构，内层为菲薄的ECs层；中层为结构致密的SMCs层；外层为结构较为疏松的结缔组织层。PCL/PU血管(n=5)厚度较大鼠腹主动脉略厚，约为(250±24) μm，也呈明显的三层结构，内层为PCL微纳米纤维层；中层为PCL/PU微纳米纤维层，外层为PCL微纳米纤维层(图 1)。

图1 大鼠腹主动脉和PCL/PU血管结构 (SEM, ×300)

Fig 1 Structure of rat abdominal aorta and PCL/PU aorta graft (SEM, ×300)

2.2 爆破压测试效果

测量仪器最大压力值120 kPa≈900 mmHg，本实验中随机抽取PCL/PU血管(n=5)，反复充压30 次，充压时膨胀，降压时收缩，该PCL/PU血管均能够保持弹性，期间PCL/PU血管未出现渗漏，其爆破压力值超过900 mmHg，可以耐受正常生理血压(图 2)。

图 2 PCL/PU血管爆破压测试

Fig 2 The burst pressure test of aorta graft

2.3 模量测试结果

通过拉伸测试PCL/PU血管模量达到(5.60±0.34) MPa，断裂伸长率可达到564%±28%；大鼠腹主动脉模量达到(2.06±0.11) MPa，断裂伸长率可达到170%±20%， PCL/PU血管强度高于大鼠腹主动脉(图 3)。

2.4 PCL/PU血管愈合

SD大鼠腹主动脉移植PCL/PU血管术后30 d取材(n=10), 其中1 只在术后1 d内死亡，探查发现死亡原因为PCL/PU血管吻合口破裂，腹腔内出血致死。其余9 只SD大鼠进食以及运动功能等均未见异常。取材样本大体观察可见PCL/PU血管均与自体血管融合良好，在外层形成丰富的滋养血管网，血流通畅(图 4)，缝线吻合处光滑，无狭窄、无动脉瘤形成(图 4)。

图 3 大鼠腹主动脉和PCL/PU血管应力应变曲线

Fig 3 The stress strain curve of rat abdominal aorta and PCL/PU aorta graft

图 4 PCL/PU血管大体观察

Fig 4 The gross observation of PCL/PU aorta graft

HE染色可见，大鼠腹主动脉的结构，内层为ECs，中层为SMCs，外层为疏松结缔组织(图 5A、 5B)； PCL/PU血管植入30 d内，也形成了类似大鼠腹主动脉的管状结构(EF)。Masson染色观察，大鼠腹主动脉外层可见大量的胶原包裹(CD)；PCL/PU血管中层和外层内可见有丰富的胶原纤维相互融合(GH)。

CD31和a-SMA分别为EC和SMC的标记蛋白，PCL/PU血管免疫荧光观察可见，内层有ECs覆盖，ECs结构完整连续，为移植血管提供了良好的封闭性(图 6A)；中层分布较多的SMCs，由内到外逐渐减少，推测PCL/PU血管中层的SMCs来源为血循环，因此短期内呈现由内到外逐渐减少的密度梯度；外层可见SMCs呈环形分布，说明短期内周围组织就有成熟的滋养血管长入(图 6B)，为PCL/PU血管的改建提供细胞来源。

图 5 大鼠腹主动脉与PCL/PU血管组织组织学观察

Fig 5 Histopathological observation of rat abdominal aorta and PCL/PU aorta graft

3 讨论

理想的人工血管需要具备良好的力学性能，能够耐受血压的变化，防止血管破裂；还需要具备良好的生物学性能，能够与自体血管相互融合，防止血管阻塞。模拟天然血管的结构和功能，是一种简洁、有效的构建人工血管方法。

PCL是一种应用广泛的生物材料，已有其运用于组织工程修复受损的表皮、神经、骨缺损、软骨缺损的报道，其具有较好的生物学性能，并且可以完全降解[4-6]。PU是一种柔韧性好具有高度弹性的材料，已有报道使用PU作为人工血管材料，但因其结构致密，限制营养物质交换，愈后不佳等原因并未广泛应用[7]。本研究创新性的结合两种材料的优点，使用静电纺丝技术来进行PCL/PU血管的制造。首先，我们使用致密的PCL纺丝构建表面较为平整的内膜层，从而有效防止血栓形成并同时利于ECs粘附。其次，疏松的PCL纺丝构建外层，模拟天然血管外层的疏松结缔组织，静电纺丝提供的高表面积比和高孔隙率，便于细胞迁入孔隙中。最后，PCL/PU纺丝构建中层，PU和PCL有相似的官能团，按比例混合可使其力学性能协同增强，模拟天然血管中层平滑肌的支撑功能[5]。PCL/PU血管植入30 d，大体观察可见，其外表面形成的丰富的滋养血管网，更加利于物质交换，内层缝合处光滑，无狭窄或血栓；HE染色证实内层形成完整平滑的ECs；中层随着PCL成分的降解，逐渐增大的孔隙更利于SMCs进入纺丝间隙中，Masson染色也证实中层内有丰富的胶原纤维的形成，从而利于PCL/PU血管维持足够的力学性能，也促使PCL/PU血管与自体组织融合；免疫荧光染色显示血管ECs在PCL/PU内表面完整覆盖，而ECs正是止血和减少血栓形成中起着关键细胞[8-9]。SMCs已长入血管中层，其细胞密度由内到外逐渐减少，提示SMC的主要来源为外周血循环，SMCs的迁入也预示着PCL/PU血管后期可能会具有舒张、收缩等血管功能；而PCL/PU血管外膜可见丰富的滋养血管；外层滋养血管长入能进一步促进材料的吸收和功能细胞的迁入[10-12]。