氯胺酮对MPTP诱导的帕金森病小鼠α-synuclein及星形胶质细胞的影响*

孙习文，宋俊杰，陈程哲，毛珊珊，刘 琨，王丹丹，李会芳，王 莹，洪道先

（河南大学第一附属医院麻醉科，河南开封475000）

帕金森病（Parkinson disease，PD）是世界上第2大神经退行性疾病，在60岁以上的人群中发病率约为2%，其症状包括静止性震颤、运动迟缓、姿势不稳、抑郁等[1]。PD的特征为多巴胺能神经元进行性丢失，其病理学标志物是错误折叠的α-突触核蛋白（α-synuclein）[2-3]。PD小鼠脑内的α-synuclein不仅能通过自身神经毒性直接损害神经元，而且能激活星形胶质细胞connexin 43半通道和pannexin-1通道，从而引起一氧化氮的释放以及线粒体形态与功能的改变，造成神经元损伤[4]。星形胶质细胞增生是PD的另一个神经病理学特征。PD病人的尸检病理报告显示，黑质内星形胶质细胞的密度增加30%左右[5]；另外，在MPTP诱导的PD小鼠脑内也存在明显的星形胶质细胞增生[6]。事实上，神经退行性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病及亨廷顿病都与谷氨酸能N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体的功能障碍有关[7]；过度激活的NMDA受体产生兴奋性毒性，导致相关神经元的损伤与丢失[8]。在啮齿类动物的研究中显示，颅脑损伤及缺血性脑损伤时应用NMDA受体抑制剂，能够降低脑的损伤程度[7]；另有研究表明，抑制NMDA受体的NR2A亚单位可以缓解PD大鼠的运动障碍[9]。地佐环平（MK-801）能够抑制海马神经元突触外NMDA受体介导的动作电位，从而降低兴奋性毒性，减少神经元的损伤[10]。氯胺酮（ketamine）作为一种非竞争性NMDA受体抑制剂，在亚麻醉剂量（7 mg/kg）下可抑制脂多糖诱导的IL-1α、IL-1β、TNF-α等炎症介质的释放[11]；还有研究表明，对小鼠腹腔注射亚麻醉剂量（10～30 mg/kg）的氯胺酮，可以产生快速、持久、剂量依赖性的抗抑郁作用[12]。故本研究用20 mg/kg的氯胺酮干预1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）诱导的小鼠，旨在探究亚麻醉剂量氯胺酮对PD小鼠α-synuclein表达及星形胶质细胞增生的影响。

材料和方法

1 实验动物及分组

SPF级健康雄性C57BL/6小鼠36只，鼠龄8～12周，体重22～32 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2016-0006。饲养温度（23±2）℃，自由饮食，自然光照，适应性饲养2周。实验小鼠随机分为NaCl组（相同时间腹腔注射与MPTP组同等体积的生理盐水）、MPTP组（腹腔注射25 mg/kg MPTP，30 min后腹腔注射与氯胺酮同等体积的生理盐水）和ketamine组（腹腔注射25 mg/kg MPTP，30 min后腹腔注射20 mg/kg氯胺酮），每组12只。以上各组小鼠均于同一时间注射，连续注射7 d。在开始药物注射后第15天进行行为学测试，在第16天处死小鼠、收集样品。

2 主要试剂

盐酸氯胺酮注射剂购自福建古田药业有限公司；MPTP购自Sigma；兔抗α-synuclein单克隆抗体、兔抗胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）单克隆抗体及羊抗鼠Ⅱ抗均购自Proteintech；鼠抗β-actin单克隆抗体购自康为世纪公司；HRP标记的羊抗鼠Ⅱ抗购自Boster。

3 实验方法

3.1 悬尾实验（tail suspension test） 在实验小鼠尾部后1/3处用橡皮筋固定，悬挂于仪器框内，使其头部向下垂，距离台面10 cm；小鼠在企图摆脱困境的过程中会出现间断性不动，用摄像机对此过程进行录制，时长为5 min；然后将录制的视频分类并用动物行为学分析软件SMART加以分析，统计小鼠的不动时间和活动度。

3.2 步态分析实验（gait analysis test） 将前爪涂有黑色墨水、后爪涂有红色墨水的小鼠放入垫有长8.9 cm、宽2.1 cm白色纸片的跑道中，让其从跑道头端向尾端自由单向爬行。爬行结束后对小鼠留下的脚印进行记录，连续两个脚印点之间的距离即小鼠步距，每只小鼠测量连续3个以上步距，最后对小鼠的步距进行统计分析。

3.3 小鼠脑切片的制备及免疫荧光染色 随机从3组小鼠中各取5只小鼠，对实验小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（10 mg/kg）进行麻醉，接着用手术刀切开小鼠前胸，暴露心脏，在心尖处插入输液针头，剪开右心房，先用生理盐水灌注15 min，再用多聚甲醛灌注2 h，待肝脏变硬后，在冰上迅速断头，将大脑完整取出并浸泡于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h。调整莱卡震荡切片机参数，将小鼠大脑切至50 μm的厚度，最后将小鼠脑切片放入防冻液中，于-20℃冰箱中保存备用。选取小鼠脑区切片，用0.2%Triton进行通透，10%山羊血清室温进行封闭，加入兔Ⅰ抗[抗α-synuclein抗体（1∶500）和抗GFAP抗体（1∶800）]，4℃过夜，PBS漂洗，加入荧光Ⅱ抗（1∶1 500）于室温避光孵育1 h，DAPI（1∶1 000）复染15 min。在荧光显微镜下（红色标记α-synuclein和GFAP，蓝色标记细胞核）观察黑质（substantia nigra，SN）、纹状体尾壳核（caudate putamen，CP）及视皮层（visual cortex，CX）内αsynuclein和GFAP的表达情况。

3.4 小鼠脑组织蛋白提取及Western blot实验 随机从3组小鼠中各取5只小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠（10 mg/kg）进行麻醉，接着用手术刀切开前胸，暴露心脏，在心尖处插入输液针头，剪开右心房，用生理盐水灌注30 min，待肝脏变白后，在冰上迅速断头并完整取出脑组织，接着进行分区，分离出SN、CP和CX，然后在冰上匀浆裂解、离心、取上清液，于-80℃冰箱中保存备用。将提取的脑组织蛋白进行定量后，进行SDS-PAGE，然后电转至PVDF膜，封闭液封闭1 h；加入兔Ⅰ抗[抗α-synuclein抗体（1∶1 000）、抗GFAP抗体（1∶1 500）及抗β-actin抗体（1∶2 000）]，4℃过夜，TBST漂洗，兔Ⅱ抗（1∶3 000）室温孵育1 h，TBST再次漂洗；加ECL化学发光液，全自动多色荧光化学发光成像系统对PVDF膜进行扫描；用ImageJ软件分析条带吸光度。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0对实验数据进行分析，数据以均数±标准误（mean±SEM）表示。多组数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 氯胺酮增大PD小鼠的步距并缩短悬尾不动时间

悬尾实验结果显示，与NaCl组相比，MPTP组小鼠不动时间延长（P＜0.05）；而与MPTP组相比，ketamine组小鼠不动时间缩短（P＜0.01），见图1A。步态分析实验结果显示，与NaCl组相比，MPTP组小鼠步距减小（P＜0.05）；而与MPTP组相比，ketamine组小鼠步距增大（P＜0.05），见图1B。此外，MPTP组小鼠悬尾实验中的活动度较NaCl组低，而ketamine组小鼠的活动度较MPTP组高，见图1C。

Figure 1.Ketamine increased the step length and shortened the duration of immobility in PD mice.A：duration of immobility in tail suspension test；B：step length in gait analysis test；C：activity level in tail suspension test.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs NaCl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs MPTP group.图1 氯胺酮增大PD小鼠的步距并缩短悬尾不动时间

2 氯胺酮抑制PD小鼠黑质、纹状体尾壳核及视皮层内α-synuclein的表达

免疫荧光染色结果显示，与NaCl组相比，MPTP组小鼠在SN、CP及CX内表达α-synuclein的细胞数目显著增多（P＜0.01）；与MPTP组相比，ketamine组小鼠表达α-synuclein的细胞数目显著减少（P＜0.05），见图2A。Western blot结果显示，与NaCl组相比，MPTP组小鼠α-synuclein的表达量显著增加（P＜0.05）；与MPTP组相比，ketamine组小鼠α-synuclein的表达量显著减少（P＜0.05），见图2B。

Figure 2.Ketamine inhibited the expression of α-synuclein in SN，CP and CX in PD mice.A：the expression of α-synuclein in SN，CP and CX was observed by immunofluorescence staining（scale bar=100 μm）；B：the protein expression of α-synuclein in SN，CP and CX was detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01vs NaCl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs MPTP group.图2 氯胺酮抑制PD小鼠黑质、纹状体尾壳核及视皮层内α-synuclein的表达

3 氯胺酮抑制PD小鼠黑质、纹状体尾壳核及视皮层内星形胶质细胞的增生

免疫荧光染色结果显示，与NaCl组相比，MPTP组小鼠SN、CP及CX内表达GFAP的细胞数目显著增多（P＜0.05）；与MPTP组相比，ketamine组小鼠表达GFAP的细胞数目显著减少（P＜0.05），见图3A。Western blot结果显示，与NaCl组相比，MPTP组小鼠SN、CP及CX内GFAP的表达量显著增加（P＜0.05）；与MPTP组相比，ketamine组小鼠GFAP的表达量显著减少（P＜0.05），见图3B。

Figure 3.Ketamine inhibited the proliferation of astrocytes in SN，CP and CX in PD mice.A：the expression of GFAP in SN，CP and CX was observed by immunofluorescence staining（scale bar=100 μm）；B：the protein expression of GFAP in SN，CP and CX was detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NaCl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs MPTP group.图3 氯胺酮抑制PD小鼠黑质、纹状体尾壳核及视皮层内星形胶质细胞的增生

讨 论

α-synuclein具有神经毒性，它可以在不同脑区异常聚集，从而驱动神经元的损伤[13]；α-synuclein被认为是PD发病机制中的主要因素[14]，因此脑内αsynuclein的表达量是检测PD小鼠模型的一项重要指标。Zhu等[15]用 30 mg/kg的MPTP对小鼠腹腔注射5 d，检测到小鼠α-synuclein的表达明显增加。本实验采用25 mg/kg的MPTP连续注射7 d，免疫荧光染色及Western blot结果显示，MPTP组小鼠在SN、CP及CX内表达α-synuclein的细胞数目及蛋白表达量均显著增加，这表明MPTP能诱导小鼠产生PD病理性标志物。MPTP不仅能诱导产生α-synuclein，还会上调动物的NMDA受体结合水平[16]；并且α-synuclein损伤海马区的学习和记忆功能也与NMDA受体的激活有关[17]。NMDA受体抑制剂可以阻断兴奋性毒性，如MK-801可以对抗MPTP的毒性，提供长达4 h的神经保护作用[18]。本实验免疫荧光染色结果显示，与MPTP组相比，经ketamine干预后的小鼠在SN、CP及CX内表达α-synuclein的细胞数目显著减少；Western blot结果也显示，ketamine干预后的小鼠脑内具有较少的α-synuclein表达量；这与王丹丹等[19]的实验结果是一致的。这些数据说明亚麻醉剂量ketamine能够减弱MPTP的毒性，对MPTP诱导的α-synuclein表达具有抑制作用。

PD小鼠的运动功能障碍与α-synuclein的表达相一致[20]。MPTP不仅诱导小鼠产生α-synuclein，还诱导小鼠出现步距减小、悬尾不动时间延长等症状[21-22]。在本实验中，注射MPTP的小鼠在步态分析实验和悬尾实验中步距减小、活动度降低、不动时间延长；这是因为α-synuclein及MPTP的毒性作用导致小鼠脑区相关神经元的损伤，从而引起一系列的运动症状[23]。悬尾实验可以快速评估动物的抑郁情况以及抗抑郁药物的效果[22]；在本实验中，MPTP诱导的PD小鼠不仅出现运动障碍还出现了抑郁症状。有研究显示，经ketamine干预的MPTP小鼠在转棒实验中运动时间延长，掉落次数减少[19]；在ketamine抗抑郁的研究中也发现，ketamine不仅延长小鼠在转棒仪上的运动时间，而且缩短小鼠的游泳不动时间，表现出高效、持久的抗抑郁作用[12]。本实验显示，与MPTP组相比，经ketamine干预后的小鼠在步态分析实验中步距显著增大，这可能与ketamine抑制PD小鼠脑区α-synuclein的表达并减弱MPTP的毒性作用有关；然而在悬尾实验中，经ketamine干预后的小鼠活动度增加，不动时间缩短，则与ketamine的抗抑郁作用有关。

越来越多的实验证据表明炎症反应、胶质细胞激活、线粒体功能障碍、氧化应激及蛋白酶体损伤也是引发和驱动PD的关键机制[24-25]。PD的另一个神经病理学特征是星形胶质细胞增生[26]；有研究表明，在小鼠暴露MPTP第5天，星形胶质细胞开始剧烈反应并且比小胶质细胞的瞬时反应时间更短[5]。本实验对小鼠脑区的星形胶质细胞进行了检测，免疫荧光染色及Western blot结果显示，注射MPTP的小鼠SN、CP及CX内GFAP的表达显著增加。王锷等[27]的细胞实验显示ketamine具有一定的抗炎作用，能够抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞释放TNF-α。在本实验中，与MPTP组相比，经ketamine干预后的小鼠在SN、CP及CX内GFAP的表达减少，说明ketamine对MPTP诱导的星形胶质细胞增生有一定的抑制作用。ketamine不仅能抑制IL-1、TNF-α等炎症介质的释放，还能降低内毒素休克小鼠的死亡率[28-29]。抗癫痫和缺血性脊髓损伤的研究也表明，ketamine通过下调炎症介质、细胞色素C和caspase-3的表达而减少神经元的死亡，发挥一定的神经保护作用[30-31]。

综上所述，本研究显示亚麻醉剂量的氯胺酮可以抑制MPTP诱导的PD小鼠α-synuclein表达及星形胶质细胞增生，并缓解小鼠的运动障碍及抑郁症状。这验证了NMDA受体抑制剂氯胺酮在PD动物模型中的功效，揭示了氯胺酮具有抑制星形胶质细胞增生的作用，同时也为PD的治疗提供了新的实验依据。