基于高迁移率族蛋白B1信号通路分析乌司他丁对早期放射性肺损伤的保护机制Δ

杨 俊，胡 克，杜春玲，卢进昌，周 磊，汤继英

(1.武汉大学人民医院呼吸内科，湖北 武汉 430060； 2.复旦大学附属中山医院青浦分院呼吸内科，上海 201700； 3.湖北医药学院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室，湖北 十堰 442000)

放射性肺损伤为胸部恶性肿瘤放射治疗常见并发症之一，早期可致肺部充血、肺泡纤维蛋白渗出增多[1]。随着放射剂量及放疗时间的增加，最终可形成肺间质纤维化[2]。研究结果显示，接受放疗的非小细胞肺癌患者放射性肺损伤发生率约为20%，并随放疗剂量增加而明显升高[3]。放射性肺损伤是影响胸部恶性肿瘤患者放疗效果的重要因素之一[4]。因此，积极防治放射性肺损伤对恶性肿瘤患者治疗的有效性具有重要意义。目前，放射性肺损伤发病机制尚未明确，大多认为与肺组织受照射后肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)及白细胞介素1β(IL-1β)参与趋化炎症反应导致肺组织异常损伤及修复有关[5]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)为重要炎症介质，既可由活化后巨噬细胞和单核细胞主动分泌，又可由损伤坏死细胞被动释放[6]。有研究结果发现，HMGB1可参与放射性肺损伤过程，与肺纤维化改变有关[7]。乌司他丁是一种具有抑制多种蛋白水解酶活力作用的糖蛋白，常用于治疗胰腺炎[8]。乌司他丁可通过抑制HMGB1蛋白表达减轻急性肺损伤程度[9]。因此，本研究基于HMGB1信号通路，探讨乌司他丁对早期放射性肺损伤的保护机制，希望为临床防治放射性肺损伤提供更多参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠36只，雌性，SPF级，周龄为10周，体质量180～270 g，平均体质量(241.36±5.42) g，购置于南京君科生物工程有限公司，货号J001。置于光暗周期12 h，室温20～26 ℃，湿度40%～70%环境中适应性喂养1周，分笼喂养，自由饮食及饮水。本研究符合《实验动物管理条例》相关规定，并通过医学伦理委员会审核。根据干预方式的不同将大鼠分为正常对照组、放射性肺损伤组及乌司他丁组，每组12只。

1.2 主要试药与仪器

10%水合氯醛溶液(上海信帆生物科技有限公司，货号XFA1600)；注射用乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司，批准文号为国药准字H19990134，规格为10万IU/瓶)；乌拉坦(美国Sigma公司，货号U2500)；PBS溶液、中性甲醛固定液、苏木素染色液、伊红染色液、酸性乙醇分化液(0.5%)、氨水溶液(0.5%)、中性树胶、全蛋白提取试剂盒、硝酸纤维素膜(0.45 μm)、5%BSA封闭液、ECL化学发光法检测试剂盒(小鼠IgG)、丽春红染色液(1×)、总RNA提取试剂盒及反转录试剂盒均购自北京索莱宝生物科技有限公司；快速瑞式-姬姆萨复合染液(上海钰博生物科技有限公司)；HMGB1、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、核转录因子κB(NF-κB)、TNF-α、IL-6、IL-1β及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗均购自美国Abcam公司；HRP标记羊抗兔二抗购自美国Abcam公司；氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司，批准文号为国药准字H51021157，规格为250 ml∶2.25 g)；肿瘤放疗模拟定位机(德国西门子公司)；60Co-γ射线放射治疗机(医院放疗科)；化学发光凝胶成像系统(美国Alpha公司)；紫外可见分光光度计(美国Thermo Fisher公司，型号GENESYS 180)。

1.3 放射性肺损伤大鼠模型构建与干预

适应性饲养大鼠1周后，以10%水合氯醛溶液腹腔注射，400 mg/kg，仰卧于处置板上充分暴露胸部，模拟机下定位；铅块遮挡左肺以及纵膈，正常对照组大鼠不进行照射，放射性肺损伤组和乌司他丁组大鼠以60Co-γ射线照射右肺，源皮距100 cm，照射视野2 cm×3 cm，照射总量30 Gy；照射完毕后，三组大鼠分笼喂养，自由饮食及饮水；照射后48 h，乌司他丁组大鼠给予注射用乌司他丁10 万IU/kg，尾静脉注射，给予正常对照组和放射性肺损伤组大鼠相同体积的氯化钠注射液，尾静脉注射；注射完毕后4 h，麻醉处死大鼠。

1.4 实验取材

(1)肺支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)细胞涂片：腹腔注射乌拉坦1 g/kg；颈部正中切口分离气管，环状软骨处作小切口，结扎左主支气管，以氯化钠注射液5 ml灌洗右肺，重复3次；离心处理弃上清液，加入PBS溶液重悬细胞制作细胞涂片。(2)肺组织：收集BALF后行开胸手术取右肺中叶组织，PBS溶液冲洗3次，裁剪为0.5 cm×2 mm组织块，置于中性甲醛固定液中固定24 h，取出依次进行脱水、透明、浸蜡和包埋处理，将蜡块置于切片机上，制成厚度为4 μm的连续切片。

1.5 肺组织形态学

采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色法。取大鼠肺组织切片，依次进行脱蜡、脱水处理后滴加苏木素染色液染色5 min，PBS溶液冲洗；滴加酸性乙醇分化液分化，PBS溶液冲洗5 min；滴加氨水溶液反应30 s，PBS溶液冲洗2 min；滴加伊红染色液染色2 min，依次进行脱水和透明处理，利用中性树胶封片，显微镜(400×)下观察染色结果。

1.6 BALF白细胞计数

采用瑞式-姬姆萨染色法。取大鼠BALF细胞涂片以快速瑞式-姬姆萨复合染液染色2 min，显微镜下观察涂片体、尾交界处染色情况，随机选取200个细胞进行细胞分类，中性粒细胞细胞质为粉红色含紫红色颗粒，嗜酸粒细胞含大量橘黄色颗粒，单核细胞质为灰蓝色，淋巴细胞为淡蓝色。

1.7 肺组织中HMGB1蛋白及下游基因蛋白表达

采用蛋白免疫印迹法。按照全蛋白提取试剂盒说明书操作，提取大鼠肺组织中总蛋白，并进行定性和定量分析；吸取40 μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳至溴酚蓝跑出，终止电泳进行转膜；硝酸纤维素膜置于水上预处理2 h后将蛋白转移至膜上，置于脱色摇床以丽春红染色液染色5 min，自来水冲洗后将膜晾干；PBS溶液从下往上将膜浸湿后，移至含5%BSA封闭液的平皿中，室温下置于脱色摇床封闭1 h；分别滴加一抗后，4 ℃过夜；滴加二抗，室温孵育2 h；按照ECL化学发光法检测试剂盒说明书操作，利用化学发光凝胶成像系统分析条带并计算各蛋白表达量。

1.8 肺组织中HMGB1蛋白及下游基因mRNA表达

采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)。按照总RNA提取试剂盒说明书操作，提取大鼠肺组织中RNA，利用紫外可见分光光度计测定260 nm和280 nm波长处吸光度，以A260/A280比值判定RNA纯度，A260/A280比值介于1.8～2.0，提示样品中RNA纯度佳可进行下一步实验。按照反转录试剂盒说明书操作，将RNA逆转录为cDNA；以GAPDH为内参基因，GAPDH上游引物为5′-AGGTCGGTGTGAACGGATT-3′，下游引物为5′-GGGGT CGTTGATGGCAACA-3′，HMGB1上游引物5′-GCTGACAAGGC TGCTTATG-3′，下游引物为5′-CCTTTGATTCGGGCCCTATC-3′，RAGE上游引物为5′-CTTG CTCTATGGGCAGCTAC-3′，下游引物为5′-ATTGCCTCGCACCGGAATTC-3′，NF-κB上游引物为5′-ATGGCAGAGGATCAGTCCTA-3′，下游引物为5′-CGGAATCGAA TAAGGCCCTT-3′，TNF-α上游引物为5′-CAGGCGGTGCC TATGTCGTC-3′，下游引物为5′-CAGGCGGTGCCTATGTCTCG-3′，IL-6上游引物为5′-CTGCAAGCAGACTTCCATCC-3′，下游引物为5′-AGTAGTATAGACAGGTCTGT-3′，IL-1β上游引物为5′-GCACGACTTGCTACGTTCAT-3′，下游引物为5′-CATGATCTT GGGGCTACTAT-3′；反应体系：SYBR Premix Ex Taq 10 μl、上游引物0.4 μl、下游引物 0.4 μl、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl、cDNA 2 μl、ddH2O 6.8 μl，总体积20 μl；反应条件：95 ℃ 5 min，1个循环，94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 10 min，1个循环；取10 μl扩增产物置于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，利用Image J软件测定灰度值，以2-ΔΔCt表示各蛋白mRNA相对表达量。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织形态学

经射线照射处理2周后，正常对照组大鼠肺组织支气管、黏膜下及肺间质中无炎症细胞浸润；放射性肺损伤组大鼠肺组织支气管、黏膜下及肺间质中有大量炎症细胞浸润，肺间质增厚；与放射性肺损伤组比较，乌司他丁组大鼠肺组织支气管、黏膜下及肺间质中炎症细胞明显减少，肺间质水肿明显缓解，见图1。

A.正常对照组；b.放射性肺损伤组；c.乌司他汀组A.normal control group; B.radiation-induced pulmonary injury group; C. ulinastatin group

2.2 各组大鼠BALF中白细胞种类计数比较

与正常对照组比较，放射性肺损伤组和乌司他丁组大鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞比例升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与放射性肺损伤组比较，乌司他丁组大鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞比例降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3 各组大鼠肺组织中HMGB1蛋白及下游基因蛋白表达

与正常对照组比较，放射性肺损伤组和乌司他丁组大鼠肺组织中HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与放射性肺损伤组比较，乌司他丁组大鼠肺组织中HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

表1 三组大鼠BALF中白细胞种类所占比例比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与放射性肺损伤组比较，#P<0.05

Note:vs. normal control group，*P<0.05；vs. radiation-induced lung injury group，#P<0.05

2.4 各组大鼠肺组织中HMGB1及下游基因mRNA表达

与正常对照组比较，放射性肺损伤组和乌司他丁组大鼠肺组织中HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β mRNA表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与放射性肺损伤组比较，乌司他丁组大鼠肺组织中HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β mRNA表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

图2 各组大鼠肺组织中HMGB1蛋白及下游基因蛋白表达

表2 各组大鼠肺组织中HMGB1及下游基因mRNA表达

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与放射性肺损伤组比较，#P<0.05

Note:vs. normal control group，*P<0.05；vs. radiation-induced lung injury group，#P<0.05

3 讨论

放疗为胸部恶性肿瘤重要治疗手段之一，主要通过α、β、γ射线以及各类X射线杀死处于分裂周期的恶性肿瘤细胞[10]。放射线在杀死恶性肿瘤细胞的同时，也不可避免地对靶器官或组织造成不同程度的直接或间接损伤。放射性肺损伤为胸部恶性肿瘤患者放疗常见并发症，肺部组织纤维化的改变不仅可限制放疗剂量，还可对患者治疗效果产生影响[11]。放射性肺损伤根据发生时间不同可分为早期和晚期。目前，早期放射性肺损伤患者多可通过对症处理得到缓解，而晚期患者肺损伤多不可逆，预后较差。因此，早期放射性肺损伤的防治成为目前临床研究热点。HMGB1是一种高度保守的炎症介质，广泛分布于哺乳动物细胞内。HMGB1可通过参与肿瘤细胞自噬、凋亡、增殖过程及促进炎症反应，造成肿瘤细胞对化疗、放疗等治疗产生抵抗[12]。徐侨翌等[13]的研究结果发现，在脂多糖诱导的肺成纤维细胞异常增殖小鼠肺成纤维细胞核内存在HMGB1的主动分泌。乌司他丁为一种蛋白水解酶抑制剂，其可通过清除机体内氧自由基和抑制炎症因子释放，减少细胞或组织损伤[14]。乌司他丁是否对放射性肺损伤具有保护作用，本研究基于HMGB1信号通路进行了分析。

本研究中HE染色结果显示，正常对照组大鼠肺组织支气管、黏膜下及肺间质中无炎症细胞浸润，放射性肺损伤组大鼠肺组织支气管、黏膜下及肺间质中有大量炎症细胞浸润，肺间质增厚；乌司他丁组大鼠肺组织支气管、黏膜下及肺间质中炎症细胞较放射性肺损伤组明显减少，肺间质水肿明显缓解。同时对大鼠BALF中白细胞种类进行计数发现，与正常对照组比较，放射性肺损伤组和乌司他丁组大鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞比例升高，与放射性肺损伤组比较，乌司他丁组大鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞比例降低。以上结果提示，早期放射性肺损伤主要表现为肺组织支气管、黏膜下及肺间质炎症细胞浸润、肺间质水肿，乌司他丁对减轻肺部损伤具有一定作用。NF-κB是一类关键性核转录因子，广泛存在于几乎所有类型细胞细胞质内。研究结果显示，TNF-α、IL-6及IL-1β等参与炎症反应各阶段的炎症因子均可受NF-κB调控[15]。时磊等[16]的研究结果发现，NF-κB的活化与放射性肺损伤肺部炎症反应和纤维化有关。RAGE基因是体内过量的糖与蛋白质结合的产物，可与人体内各种组织细胞结合参与糖尿病、动脉粥样硬化等慢性退化性疾病[17]。研究结果显示，HMGB1主要通过与RAGE结合参与炎症反应等病理过程[18]。TNF-α、IL-6及IL-1β为常见促炎因子，与放疗所致肺损伤密切相关[19-20]。本研究结果显示，与正常对照组比较，放射性肺损伤组和乌司他丁组大鼠肺组织HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白和mRNA表达水平明显升高，而乌司他丁组大鼠肺组织HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白和mRNA表达水平较放射性肺损伤组明显降低。

综上所述，乌司他丁可能通过降低HMGB1及其下游蛋白表达，中断HMGB1信号通路，减轻早期放射性肺损伤大鼠肺部炎症细胞浸润，有可能成为预防和治疗早期放射性肺损伤的药物。