超高效液相色谱法测定人血浆替考拉宁浓度Δ

2020-07-06刘慧芳王晓雪陈文倩杜雯雯李朋梅张相林

中国医院用药评价与分析 2020年2期

刘慧芳，王晓雪，陈文倩，秦伟，张丹，杜雯雯，李朋梅，张相林

(中日友好医院药学部，北京 100029)

替考拉宁为糖肽类抗菌药物，在临床被用于治疗各种严重的革兰阳性菌感染，与现有其他糖肽类药物相比，其组织穿透率改善，而肾毒性显著降低。特别是对于耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)感染，替考拉宁可用于万古霉素替代治疗，安全有效[1-3]。负荷剂量给药时，由于年龄、潜在疾病(如白血病)、肾功能及血清白蛋白水平等个体间差异，替考拉宁的血清浓度是高度可变的，因此，监测其血药浓度具有重要意义[4-5]。近年来，测定替考拉宁血药浓度的方法主要有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)[6-7]和液相色谱-质谱法(liquid chromatograph mass spectrometry，LC-MS)[8-9]。与LC-MS相比，HPLC具有内标较易获得、对实验室条件要求低及临床参考范围明确等优点，被广泛用于临床治疗药物监测。替考拉宁是主要由5个结构近似的化合物(TA2-1、TA2-2、TA2-3、T2-4和TA2-5)组成的混合物，其中以 TA2-2为主，占各组分总含量的 40% 以上。目前主要有两种定量方法：(1)将5种成分的峰面积加和进行定量；(2)采用TA2-2的峰面积进行定量计算。但何勐等[6]指出，上述两种定量方法虽无显著差异，但定量方法(1)会出现 TA2-1、TA2-3、T2-4和TA2-5的峰检测不到以及可能还会出现这4个峰与其他杂质峰达不到有效分离[6]。本研究建立的超高效液相色谱法(ultra-performance liquid chromatography，UPLC)，以TA2-2为考察对象，简化了血浆前处理方法，以对羟基苯甲酸甲酯为内标，具有快速、简便、准确且可靠的特点及内标稳定的优势，更加适合替考拉宁的血药浓度测定，现报告如下。

1 材料

1.1 仪器

UPLC仪(日本岛津公司)，LC-20AD泵、DGU-12AS在线脱气机、SIL-20AC自动进样器、CTO-20 A柱温箱、CBM-20 A系统控制器、SPD-M20 A 检测器及LabSolutians 色谱工作站；JingLi LDZ5-2型低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)；Sigma 3K15型超高速离心机(美国Sigma公司)；CPA225D型万分之一电子分析天平(德国 Sartorius公司)； Vortex Genie 2型多用途旋涡混合器(美国Scientific Industries公司)；Milli-Q Advantage A10型纯水机(法国Millipore公司)。

1.2 药品与试剂

替考拉宁对照品(中国食品药品检定研究院，批号为130374-201002，每1 mg含894 IU)、对羟基苯甲酸甲酯对照品(国药集团化学试剂有限公司，批号为20160509，纯度≥98.5%)；甲醇、乙腈均为色谱纯(Fisher Scientific，美国)；NaH2PO4为分析纯；实验用水均为Millipore超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为 Waters Symmetry C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)柱，流动相为0.01 mol/L的NaH2PO4(pH=3.3)-乙腈(V∶V=77∶23)，检测波长为215 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为35 ℃，进样量为10 μl。

2.2 替考拉宁储备液的制备

精密称取替考拉宁对照品20.65 mg，置于100 ml容量瓶中，加10%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成 2.065 mg/ml的溶液，分装并于-80 ℃冻存备用。

2.3 内标溶液的制备

精密称取对羟基苯甲酸甲酯对照品51.07 mg，置于50 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得1.0 214 mg/ml的内标储备液，取内标储备液1 ml，置于10 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得102.14 μg/ml 内标溶液，分装并于-80 ℃冻存备用。

2.4 标准曲线和质量控制(quality control，QC)样品制备

吸取空白血浆950 μl于1.5 ml离心管中，精密加入替考拉宁储备液50 μl，用空白血浆进行等比稀释，分别配制成质量浓度为103.25、51.63、25.81、12.91、6.45及3.23 μg/ml的系列溶液作为标准曲线点。另取空白血浆适量，加入替考拉宁储备液，依次配制为34.42、11.47及3.84 μg/ml的高、中及低3个质量浓度的QC样品。

2.5 血浆样品前处理

取血浆样品 200 μl于离心管中，加内标溶液(102.14 μg/ml)20 μl、90%乙腈300 μl，涡旋混匀5 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液10 μl进样检测。

2.6 专属性考察

替考拉宁和内标储备液稀释后直接进样测定；空白血浆、空白血浆+替考拉宁标准液+内标标准液及患者血浆+内标标准液按照“2.5”项下方法处理后进样分析，见图1(图中标示TKLN为TA2-2的峰，IS为对羟基苯甲酸甲酯的峰)。结果表明，替考拉宁TA2-2与内标基线分离且峰形良好，空白血浆中未见干扰。

A.替考拉宁标准液；B.内标标准液；C.空白血浆；D.空白血浆+替考拉宁标准液+内标标准液；E.患者血浆+内标标准液A.standard liquid of teicoplanin; B.Internal standard liquid; C.blank plasma; D.blank plasma+standard liquid of teicoplanin+internal standard liquid; E.patient’s plasma+internal standard liquid

2.7 标准曲线的绘制

将“2.4”项下制备的作为标准曲线点的系列溶液，按“2.5”项下方法处理后进样检测，以替考拉宁TA2-2组分与内标峰面积的比值(Y)为横坐标，替考拉宁的质量浓度(X)为纵坐标，绘制线性回归标准曲线。回归方程为:Y=19.092X+0.408 7，r2=0.999 7，替考拉宁质量浓度在3.23～103.25 μg/ml范围内线性关系良好，此方法的定量限为3.23 μg/ml。

2.8 提取回收率考察

A为替考拉宁3个质量浓度QC样品；B为用流动相稀释制备与A质量浓度相同的低、中及高3个浓度的替考拉宁标准溶液样本；分别平行制备5份。均按“2.5”项下方法处理后进样分析，计算提取回收率。计算方法为：提取回收率=峰面积A/峰面积B×100%，结果见表1。

表1 提取回收率结果(n=5)

2.9 准确度和精密度考察

取替考拉宁3个质量浓度的QC样品，每个质量浓度5份，按“2.5”项下方法处理后进样分析，连续测定3 d，计算批内和批间变异。结果见表2，表明此方法的准确度和精密度符合要求。

表2 替考拉宁测定方法的准确度、精密度结果(n=5)

2.10 稳定性考察

(1)取患者血浆样本，按“2.5”项下方法处理后进样测定；在室温(25 ℃)下存放 24 h 后，再按“2.5”项下方法处理后进样测定，结果无显著差别(RSD<15%)，表明室温条件下放置 24 h 稳定。(2)反复冻融试验：低、中及高3 个质量浓度的含药血浆样本，-20 ℃冷冻保存，融化放至室温，再次冷冻24 h，融化至室温后，按“2.5”项下方法处理后进样分析，结果表明，冻融稳定性良好(RSD<15%)。(3)长期稳定性实验：低、中及高3 个质量浓度的含药血浆样本，-80 ℃冷冻保存3个月，融化至室温后，按“2.5”项下方法处理后进样分析，结果表明，长期稳定性良好(RSD<15%)。

2.11 临床样本测定

收集中日友好医院15例临床患者样本，测得替考拉宁谷浓度(Cmin)结果见图2。替考拉宁平均Cmin为(17.990±9.991)μg/ml；其中，<10 μg/ml者3例，占 20%，10～30 μg/ml者11 例，占 73.33%，>40 μg/ml者1例，占 6.67%。按照替考拉宁药品说明书中参考值：对于大多数革兰阳性菌感染，替考拉宁谷浓度应至少达到10 μg/ml；对于心内膜或其他重症感染，替考拉宁谷浓度应达到15～30 μg/ml。由此可见，15例患者中至少有3例患者仍需根据病情程度调整给药剂量，及时给予足够的替考拉宁负荷剂量，提高临床疗效。

图2 临床患者样本测定结果

3 讨论

3.1 血浆样品预处理方式的选择

文献报道的替考拉宁预处理方法多为乙腈沉淀蛋白后，二氯甲烷或三氯甲烷萃取法[6]。但考虑到萃取法成本高且操作繁琐，本研究在预处理方法的选择上比较了乙腈、甲醇、5%高氯酸和乙腈(含0.1%甲酸，V/V)四种溶剂。结果发现，采用乙腈进行预处理的信号较高，但不成比例。考虑到替考拉宁易溶于水，因此，比较了不同比例乙腈沉淀蛋白的提取回收率。结果发现，预处理方法采用90%乙腈沉淀蛋白时的提取回收率最高，故本研究采用90%乙腈直接沉淀蛋白进行样本预处理。该方法操作简便，极大提高了工作效率。

3.2 内标的选择

内标物质应具有性质稳定、方便获得且临床样本中无干扰等特点。目前，文献中多采用哌拉西林作为内标物质[6]。但哌拉西林溶液的稳定性较差、出峰时间容易受pH的影响且患者样本中容易有外源药物的干扰，因此，对样本、实验过程及流动相配制过程都要求严格。本研究采用对羟基苯甲酸甲酯作为内标，不仅可以最大程度减少外源性药物的干扰，而且室温下24 h稳定性良好(RSD<5%)。