基于流式细胞术的乌饭树核DNA含量（2C-值）测定

黄婧 张敏 林峰 周鹏 周洁

摘 要：  核DNA含量（2C-值）是描述植物生物多样性的一个重要特征参数。该研究利用流式细胞仪检测越橘属植物乌饭树核DNA含量，建立了适合乌饭树的流式细胞术测定方法：以野生乌饭树的嫩叶为材料，以已知核DNA含量的水稻品种‘日本晴为内标，采用GPB解离液，细胞核悬液加入50 μL 瘙 簚 mL-1碘化丙啶染色5 min即可上机检测。结果表明：（1）9个乌饭树单株的核DNA含量平均值为（1.22±0.03） pg，最小值为1.18 pg，最大值为1.27 pg。（2）检测结果与已知的越橘属二倍体植株的2C-值含量相似，且不同地理来源的单株DNA含量没有显著差异（P>0.05），推测这9个单株为二倍体植株。（3）测定的乌饭树核DNA含量（2C-值）可丰富越橘属植物的C-值库;基于流式细胞术建立的乌饭树核DNA含量测定方法可为该属其他植物的相关研究提供借鉴。

关键词： 乌饭树， 核DNA含量， 2C-值， 流式細胞术

中图分类号：  Q946

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2020）05-0680-07

Determination of nuclear DNA content （2C-value） of Vaccinium bracteatum by flow cytometry

HUANG Jing1， ZHANG Min1*， LIN Feng2， ZHOU Peng1， ZHOU Jie1

（ 1. Jiangsu Academy of Forestry， Nanjing 211153， China; 2. Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China ）

Abstract：  The plant nuclear DNA content （2C-value） is a principal characteristic parameter to describe biodiversity of plant species. For better understanding the nuclear DNA information of this plant， the nuclear DNA content of Vaccinium bracteatum wild plants were estimated by flow cytometry （FCM）. In order to establish the optimal FCM method， young fresh leaves were taken as samples， and Oryza sativa subsp. japonica ‘Nipponbarewith known nuclear DNA content was set as internal standard. The nucleus of the mixed leaf cells was isolated by GPB dissociation solution and stained with 50 μLmL-1 propidium iodide （PI） with 5 min， then the PI emission fluorescence intensity was measured by flow cytometry. The results were as follows： （1） The average nuclear DNA content of nine Vaccinium bracteatum plants was （1.22±0.03） pg， the minimum value was 1.18 pg and the maximum was 1.27 pg. （2）The results were similar to the nuclear DNA content of the known diploid plants of Vaccinium， and there was no significant differences in DNA content of plants from different geographical origins （P>0.05）. It is speculated that these nine V. bracteatum plants are diploid plants. （3） The detected nuclear DNA contents （2C-value） of V. bracteatum can enrich the C-value database of Vaccinium. The nuclear DNA content detection method established based on FCM for V. bracteatum can provide reference for related research of other Vaccinium species.

Key words： Vaccinium bracteatum， nuclear DNA content， 2C-value， flow cytometry （FCM）

真核生物体细胞核中，染色体组数和DNA含量保持一定的数值，为了将DNA含量与染色体数目相区分，Swift et al.（1950）提出了C-值（C-value）的概念，C-值是指真核生物细胞中，没有复制的单倍体细胞核（无论倍性水平）所含的DNA总量。C-值的单位可以用皮克（pg，1 pg=10-12 g）表示，1 pg DNA代表0.978×109碱基对（base pairs，bp）（Dolezel et al.， 2003）。C-值是植物的一项重要特征参数，与生物体的细胞大小、寿命、光合速率等生理参数有一定的相关性（Beaulieu et al.， 2007），同时C-值具有种的特征，也与植物的种群进化、遗传信息总量等有密切关系，因此对植物的C-值进行研究有重要意义。目前，植物C-值数据库（http：//data.Kew.org/cvalues/）包含超过8 500个种的数据，包括被子植物、裸子植物、蕨类、苔藓、藻类的C-值数据，方便科研工作者查询与分析。

核DNA含量一般被称为含有2C的DNA含量（Dolezel & Bartos， 2005），这是由于在有丝分裂间期，细胞核含有两份未复制的基因组拷贝。核DNA含量的测定方法主要有化学分析法、复性动力学法、孚尔根染色法（feulgen microdensitometry）、流式细胞术（flow cytometry，FCM）等方法。化学分析法和复性动力学法现在已经很少被使用了;孚尔根染色法操作复杂且结果不够稳定（Moscone， 2003）。Galbraith et al.（1983）报道了应用流式细胞术测定植物细胞周期检测和细胞核DNA含量的研究，开辟了流式细胞术应用于植物研究的先河。流式细胞仪（flow cytometer）操作方便迅速，结果准确可靠，目前被广泛应用于植物C-值的测定中（金亮等，2016），其工作原理是利用特殊的荧光染料与DNA碱基结合，激光照射被荧光染料染色的细胞会发射出荧光，由于荧光强度与DNA含量成正比的原理，通过测定细胞的荧光强度即可推算出样本细胞的DNA含量。由于不同植物、组织中的细胞内含物和次生代谢物质不同，针对不同研究对象，采用适合的细胞核提取液配方、提取和染色方法是流式细胞术的应用难点。

目前，利用流式细胞术已经测定了越橘属7个种的核DNA含量（Costich et al.， 1993），分别是旱地蓝莓（Vaccinium  pallidum）1.21 pg，北方越橘（V. boreale）1.18 pg，蓝莓‘埃利奥特（ V. elliottii）1.26 pg，加拿大蓝莓（V. myrtilloides）1.26 pg，南方蓝莓（V. tenellum）1.30 pg，蓝莓‘达柔（V. darrowi）1.31 pg，北高丛蓝莓（V. corymbosum）1.33 pg。然而尚无关于越橘属植物乌饭树核DNA含量的研究报道。乌饭树（V. bracteatum）又名南烛，古称染菽，是属于越橘属的常绿灌木。在我国主要分布在浙江、福建、江西、湖南、江苏和台湾等地的丘陵地带。乌饭树具有很高的营养价值和保健功能（Lee et al.， 2014），亦是不可多得的盆景及园林绿化树种。乌饭树作为一种特色保健乡土树种，具有极高的开发利用价值，但是其基因与基因组层面的研究甚少，严重限制了种质资源的利用和育种进程。本试验摸索乌饭树的流式细胞术测定方法，检测乌饭树野生单株的核DNA含量，并分析基因组倍性情况以及核DNA含量变化与种质地理来源之间的关系，以期为乌饭树的种质资源研究、基因组学和倍性育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

以来自3个省份的9个野生乌饭树单株为研究对象，其来源省份见表1。以植物鲜嫩叶片为材料，标准植物水稻‘日本晴（Oryza sativa subsp. japonica ‘Nipponbare， 2C=0.795）（Sasaki & Burr， 2000）为内部标样。

1.2 标本制作

1.2.1 解离液选择与荧光染料配制 采用LB01、Galbraiths、WPB、GPB和Tris-MgCl25种配方进行试验，找出测定乌饭树基因组的最佳解离液配方。配制碘化丙啶PI染色液（50 μL 瘙 簚 mL-1，含RNA酶），4 ℃保存。

1.2.2 细胞核悬液制备与DNA特异性染色 制备待测样、标样、待测样+标样混合的细胞核悬液。取待测样品和标样嫩叶各50 mg，一起放入置于冰上的塑料平皿中，加入1 mL预冷的解离液，用锋利刀片迅速切碎叶片。使用移液枪吸取塑料平皿中的解离液（弃去碎材料），置于1.5 mL EP管，用孔径为40 μm无菌注射式过滤器过滤，得滤液至新管内，置于冰上孵育5 min。4 ℃，800 r·min-1离心5 min，小心吸取上清置于新管中。再加入500 μL 配置好的PI-Rnase染液，避光染色5～10 min。另取待测样品、标样的嫩叶各50 mg，按照同样的方法分别备至细胞核悬液作为空白对照，空白对照以同样的方法进行染色。将染色的细胞核悬液转入标准上样管中，上机测定。

1.3 流式细胞仪检测及分析

利用BD InfluxTM流式细胞仪对染色后的细胞核悬液样品上机检测，采用488 nm的激光激发，收集670/30通道的荧光，检测荧光强度。每个待测样品收集约10 000个细胞，每管样品测试3次，并在不同日期进行2次重復，取平均值计算。

使用仪器自带软件进行作图分析。已知核DNA含量的水稻‘日本晴的实生幼苗为参照样本，按照以下公式计算得到待测样品的核DNA含量，其中G0/G1峰的变异系数（coefficient of variation，CV=标准差/平均值×100%）CV值大于5%的结果予以舍弃（Arumuganathan & Earle， 1991a）。并根据1 pg DNA =978 Mp，计算乌饭树的基因组大小。

2 结果与分析

2.1 解离液的选择

由于不同解离液对不同植物的解离效果存在明显差异，在乌饭树核DNA含量检测前，比较5种植物常用的解离液（LB01、Galbraiths、WPB、GPB和Tris-MgCl2）对乌饭树叶片的解离效果。发现GPB解离液对乌饭树和水稻叶片细胞核的解离效果最佳，其细胞核悬液的浓度较高，上机检测能得到较好的荧光信号：噪音少、峰形佳、面积相对较大，变异系数控制在5%以内。因此，本研究采用GPB解离液制样进行测试。

2.2 待测样品的荧光强度范围确定

为了控制试验误差，试验采用内标法进行测定，经查询、比较常用的植物标样和部分越橘属植物的2C-值后，选择水稻‘日本晴作为标准样品。以水稻‘日本晴、乌饭树样本单独上机检测，通过观察流式细胞术检测图中峰的位置，初步确定标样与待测样本的荧光强度范围。在同一检测模板下，水稻‘日本晴的荧光强度峰值在10 000附近（图1），乌饭树的荧光强度峰值在17 000附近（图2）。由于细胞核的荧光强度与核DNA含量成正比，说明水稻‘日本晴的核DNA含量小于乌饭树;同时可以推测，在下一步混合样本的流式细胞术检测图中，代表水稻的峰应位于流式细胞术检测图的左侧，而代表乌饭树样品的峰应位于图的右侧。

2.3 乌饭树核DNA含量（2C-值）的测定结果

分别将9份乌饭树测试样本与水稻标样的混合样本上机测试，测试结果如图3所示，水稻与乌饭树混样的主峰区分度良好，均清晰且无重叠，说明本试验方法准确可行。分别比较各乌饭树测试样本与水稻标样的G0/G1期峰值相对位置，图中左侧的P1峰代表标样水稻‘日本晴的荧光强度，右侧的P2峰代表乌饭树测试样本的荧光强度。

乌饭树测试样品的核DNA含量（2C-值）见表2。9个样本的平均核DNA含量（2C-值）为1.22 pg，标准差为0.03。最大的是样本6号，为1.27 pg，最小的是样本5号，为1.18 pg。经单因素方差分析（表3），不同省份的野生单株之间核DNA含量无显著差异（P>0.05），说明乌饭树核DNA含量没有因地理分布不同而产生进化差异。检测结果与已知的二倍体越橘品种的核DNA含量（1.18～1.31 pg）相似，且前人的研究表示三、四倍体越橘品种的核DNA含量显著大于二倍体（P<0.05）（Costich et al.， 1993），因此，推测本试验鉴定的9个单株均为二倍体植株。

一般认为植物DNA 1 pg相当于978 Mb。本试验测得乌饭树核DNA含量（2C-值）为（1.22±0.03）pg，推测乌饭树基因组大小约为（1 194.39±29.07）Mb。

3 讨论

本研究首次利用流式细胞术检测乌饭树核DNA含量（2C-值）。测试得到乌饭树野生单株核DNA含量（2C-值）平均值为（1.22±0.03）pg，基因组大小约为（1 194.39± 29.07）Mb。检测单株与越橘二倍体品种的核DNA含量近似，且不同省份来源的野生单株的核DNA含量无显著差异（P>0.05），推测供试单株均为二倍体植株。本研究旨在为乌饭树基因组学研究、遗传多样性研究和育种工作奠定基础。

流式细胞术根据样本的相对荧光强度来分析其DNA含量，是一种快速准确鉴定植物基因组大小及倍性的方法。前人利用流式细胞术检测越橘属植物2C-值时使用的解离液（Arumuganathan & Earle， 1991a）和外标样品（Costich et al.， 1993）（虹鳟鱼红细胞），目前已不常在植物研究中使用，因此本研究自行摸索了乌饭树的流式细胞术试验方法。最终采用水稻‘日本晴作为内标，选择GPB解离液，使用红色或鲜绿色的乌饭树鲜叶制备细胞悬浮液，经50 μL 瘙 簚 mL-1 PI溶液染色5 min即可上机检测。该方法相比于前人對越橘属植物的测定方法简化了许多，结果重复性较好，CV值控制在5%，可为本属其他植物的流式细胞术研究提供参考。

本研究随机挑选了分布在江苏、湖南、江西的9个单株，检测结果均为二倍体植株。这与越橘属其他植物的基因组特性（孙海悦和张亚东，2014）有类似之处，生长在美国东南部温暖湿润地区的常绿越橘（Vaccinium darrowi）、兔眼越橘（V. virgatum）、小穗越橘（V. tenellum）都是二倍体植株（2n=2x=24）;生长在严寒地区的北高丛蓝莓、矮丛越橘（狭叶越橘为主）品种多是四倍体植株（2n=4x=48）。乌饭树与其他越橘属植物的分布范围不同，目前只发现生长在温暖湿润的地区，尤其是丘陵地带或海拔400～1 400 m的山地（郝娟娟，2010），结合本试验的结果，推测乌饭树可能是二倍体植物。但由于试验检测的乌饭树单株数量较少，尚不能确定乌饭树是否存在三、四、六倍体，还需要检测更多植株，尤其是生长量大、株高较高，以及生长在低温地区的植株。同时，在今后的育种工作中，可以利用乌饭树的耐热和低冷温需要量基因，对耐冷的北方越橘品种进行改良，扩大其种植适应范围。

越橘属植物种类繁多，并且经过长期的自然选择，遗传变异丰富，前人研究发现，越橘属不同倍性植株的核DNA含量大小存在显著差异（P<0.05），甚至在二倍体品种之间也存在一定差异（Costich et al.， 1993），这种现象在其他植物中也被证实存在（吴丽萍等，2013;陈丙以等，2015;林峰等，2017）。本研究中不同省份的乌饭树二倍体单株核DNA含量没有显著差异（P>0.05），暗示这些乌饭树的核DNA含量可能没有受到地理环境影响而发生遗传进化。但对于不同地理环境是否造成种群遗传进化差异，仅根据本次试验结果，尚无法得出确定的结论，可以利用分子标记开展不同种源种质的遗传多样性的研究，进一步了解乌饭树种质的遗传进化进程。

根据植物C-值大小的5个等级（Leitch et al.， 1998; Soltis et al.， 2003）划分，乌饭树属于“很小（1C-值≤1.4 pg）”的植物;利用测得的二倍体单株的核DNA含量预测，乌饭树基因组大小约为（1 194.39 ± 29.07）Mb。对照前人的研究结果（Arumuganathan & Earle， 1991b），估计乌饭树基因组大小是拟南芥的4倍，玉米的1/5，番茄的1/2，远大于木瓜、芒果、杏、樱桃、橙和覆盆子等水果植物。该结果能够为乌饭树基因组的研究提供一些依据。

目前，国内尚无关于乌饭树核DNA含量的研究报道，本研究结果可以丰富越橘属植物的C-值库，基于流式细胞术建立的乌饭树核DNA含量测定方法可为加快越橘属植物的相关研究提供借鉴。

参考文献：ARUMUGANATHAN K， EARLE ED， 1991a. Estimation of nuclear DNA content of plants by bow cytometry  [J]. Plant Mol Biol Rep， 9（3）：229-241.

ARUMUGANATHAN K， EARLE ED， 1991b. Nuclear DNA content of some important plant species  [J]. Plant Mol Biol Rep， 9（3）：208-218.