RNA干扰沉默胃癌细胞FasL表达的抗肿瘤免疫作用

何茂钦， 谭笑杏#， 阿合提别克·塔布斯， 马博， 李剑辉

在我国，胃癌的发病率、死亡率高居第2位，仅次于肺癌［1］，也是全球癌症死亡主要病因之一［2］。近年来胃癌的治疗较以往已有很大的改进，但其5年总生存率低于25%，仍然不能令人满意［3］。胃癌发病原因尚未明确，已有学者发现胃癌细胞能够抑制NK细胞增殖，并诱导其凋亡，从而导致机体免疫功能异常［4］。肿瘤细胞的“反击”可能是恶性肿瘤疾病进展的原因。目前已知促进细胞凋亡的TNF超家族（如DR3、DR5、FasL、Fas），抑制细胞凋亡的有IAP家族（如Livin、Survivin）、Bcl⁃2家族、FLIP、NF⁃kB等。胃癌细胞能够高表达FasL、Liv⁃in、Survivin［5］，从而逃避机体免疫。我们应用RNA干扰技术（RNA interferrence，RNAi）抑制胃癌细胞表达FasL，并将处理过的胃癌细胞与肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）细胞共培养，探讨其中可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

RPMI1640培养液、Hanks和PBS平衡液自行配制；丝裂霉素C（MMC）、促有丝分裂原ConA购自Sigma公司；淋巴细胞分离液由上海生化试剂二厂生产（比重1.077）；T细胞分离和纯化柱（RTCC⁃5）和红细胞溶解试剂盒购自加拿大真达科技公司。Plasmid Mini Purification Kit，Lipofectamine，胎牛血清，聚凝胺购自Gibco公司，G418购自Promega，各限制性内切酶购自TaKaRa公司。IL⁃12P70和IFN⁃γELISA检测试剂盒购自晶美公司；细胞毒性分析试剂盒 Cyto Tox 96®Non⁃Radicative Cytotoxicity Assay Kit为Promega公司产品。mIL⁃12基因真核表达载体、DH5α大肠杆菌、PA317细胞、NIH3T3成纤维细胞，人外周血PBL取材自临床标本。

1.2 方法

1.2.1 胃癌细胞采集及Fas/FasL检测 取临床手术所切除胃癌组织标本（胃窦癌标本48例，胃体癌标本15例，Ⅰ期胃癌占10%，Ⅱ期占23%，Ⅲ期占67%，部分为新鲜手术标本，部分来源于组织标本库）。无菌条件下切取胃癌组织标本，经无菌Hanks液漂洗，用含1 g/L的Ⅰ型胶原酶、0.02 g/LⅡ型DNA酶和0.5 g/LⅠ型蛋白酶（Sigma Chemical Co，St.Louis，MO）的溶液消化肿瘤组织标本，获得细胞悬液。将上述细胞培养液制作细胞涂片，以S⁃P免疫组织化学染色方法，检测人胃癌细胞Fas/FasL蛋白的表达情况。

1.2.2 肿瘤特异性CD8+CTL提取、特异性T淋巴细胞的建立 淋巴细胞分离液常规分离胃癌患者外周抗凝血PBL，离心后吸取中间乳白色的淋巴细胞层。提取胃癌细胞膜表面抗原。96孔细胞培养板中加入单个或数个目标T细胞（有限稀释法），再分别加入一定数量的肿瘤上皮抗原、饲养细胞、ConA和IL⁃2。在5%CO2温箱中，37℃及95%湿度下培养1 h，将非贴壁细胞吸至离心管，再用37℃预温的完全（含血清）RPMI⁃1640液轻轻荡洗培养瓶，并将洗涤液亦收集到离心管中，在18～20℃下，离心10 min，弃上清，用5～10 mL完全RPMI⁃1640液重悬细胞，台盼蓝染色并计数活细胞，调整细胞浓度至0.5～1.0×107/mL。

1.2.3 构建siRNA载体并转染胃癌细胞后与CD8+CTL共培养 流式细胞仪检测胃癌细胞中FasL的表达，提取FasL⁃mRNA，设计并合成特异性引物。按文献报道方法合成FasL siRNA双链分子（FasL⁃shRNA），检测其基因沉默效应，序列经BLAST同源比较分析后显示与其他人类基因序列无同源性。构建携带上述shRNA的silencer质粒载体并通过转染体外培养的细胞检测其表达效率和抑制作用。构建携带上述shRNA的蔓病毒pLL3.7载体，同上述silencer质粒载体处理方法检测表达效率和抑制作用。转染前24 h，以1×105个/孔接种生长至对数期的目标细胞于6孔板，将已制备好的FasL⁃siRNA混合物加入6孔板，阴性对照组仅加入脂质体，空白对照组不做处理，转染参照LppofectamineTM2000说明，转染后培养。收集转染48 h的3组细胞，加入MTT溶液（5 mg/mL），确定靶细胞最佳浓度，即光密度值至少为培养基对照光密度值的2倍。然后加入培养基共同培养。培养3 d、5 d、7 d后，酶标仪测定各个孔的吸光度值（A值）。实验重复3次。

1.2.4 细胞侵袭能力及胃癌细胞凋亡率检测 实验前在Transwell小室中间的聚碳酸酯滤膜上铺上已预先稀释好的Matrigel胶。将生长至对数期的T细胞制备成不含血清的单细胞悬液100μL（约1×105个细胞），接种于Transwell小室的上室，Tran⁃swell小室下室的每孔中加入含血清的培养基500μL，培养箱中孵育24 h，取出小室，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%的结晶紫染色10 min，PBS洗涤后将小室转移至24孔板，随机选择6～8个视野，倒置显微镜观察穿膜细胞数，取均值。实验重复3次。依赖Ca2+的磷脂结合蛋白Annexin V能够和PS（磷脂酸丝氨酸）高亲和结合。荧光素（FITC）标记的Annexin V被当作检测细胞膜表面PS的敏感探针，流式检测凋亡细胞。

2 结果

2.1 处理前后胃癌细胞表达FasL情况

免疫组化结果显示胃癌细胞有高表达FasL（图1），而低表达Fas，可诱导表达Fas受体的宿主淋巴细胞凋亡（图2），该机制可能参与了肿瘤的免疫逃逸，使肿瘤细胞逃避Fas/FasL系统介导的免疫清除作用。在导入FasL⁃siRNA（shRNA）后，流式细胞仪检测实验组胃癌细胞表达FasL量比较转染前呈明显下降，且实验组胃癌细胞在转染后比阴性对照组及空白对照组的FasL表达量均明显减少，差异存在统计学意义（P＜0.05），阴性对照与空白对照组间比较无明显差异（P＞0.05）。

图1 人胃癌细胞Fas/FasL表达情况 A、B、C：DAB染色；D：转染前后各组胃癌细胞FasL表达情况

图2 FasL的宿主淋巴细胞凋亡 A：200×；B：100×

2.2 经肿瘤特异性抗原处理CTL对比

未免疫的淋巴细胞，呈球形或卵圆形，表面较光滑，有较多的颗粒和少量的微绒毛；经免疫的淋巴细胞则表现为不典型的异常形态：表面有皱褶和少量微绒毛，甚至可见到长长的“伪足”，形态上类似单核细胞；有时细胞表面呈绒毛状，有许多树突状突起，形态上类似树突状细胞（图3）。在酶联免疫检测仪上测得570 nm的OD值，显示经免疫后的淋巴细胞对不同浓度ConA的增殖能力。肿瘤抗原免疫（阳性）组与未免疫（阴性）组的增殖反应经统计比较，前者显著高于后者（P＜0.05；n=10）。

图3 电镜下观察经肿瘤免疫淋巴细胞超微结构改变 A：未免疫淋巴细胞表面少量的微绒毛；B：经免疫淋巴细胞表面可见“伪足”改变；C：肿瘤免疫后T细胞对不同浓度ConA的增殖能力

2.3 胃癌细胞与肿瘤特异性抗原处理CTL共培养结果

采用MTT法检测各组在培养3 d、5 d、7 d后的吸光度值（OD），分析淋巴细胞的生长情况，结果显示，培养5 d、7 d后实验组的培养孔计数显示肿瘤特异性CTL数量比阴性对照组及空白对照组明显增多，差异存在统计学意义（P＜0.05）（见图4）。

图4 各组淋巴细胞在各时间点吸光度值测量值

2.4 胃癌细胞侵袭能力及细胞凋亡率检测结果

侵袭试验亦显示RNA干扰沉默降低了胃癌细胞的侵袭能力，经肿瘤细胞抗原处理过的CTL对胃癌细胞的特异杀伤效果显著（图5）。流式细胞仪检测的各组细胞凋亡率结果显示，FasL⁃siR⁃NA的高表达能提高胃癌细胞凋亡率（图6）。

图5 CD8+CTL细胞和胃癌细胞的共培养侵袭试验显示RNA干扰沉默降低了胃癌细胞的侵袭能力 A：200×；B：00×；**/*，与VC比较，P＜0.05

图6 高表达FasL⁃siRNA的胃癌细胞凋亡率升高，细胞呈双阳性（Annexin V+/PI+）

3 讨论

人体细胞增殖与凋亡异常，可能导致细胞恶性转化。细胞凋亡可通过内源性和外源性两个途径触发，Fas/FasL途径为外源性途径，即可通过Fas受体与FasL结合发生三聚化，进而使Fas胞浆段（死亡结构域，death domain）活化，使下游通路被激活。机体内多种组织和细胞均可组成或经激活诱导表达Fas，表达水平有较大变异，但以免疫系统的表达最丰富。FasL的表达较局限，主要存在于活化的T淋巴细胞、NK细胞、LAK细胞等免疫细胞的胞膜上。研究表明［6-8］，通过干扰Fas/FasL通路能影响细胞凋亡，说明Fas/FasL系统在细胞凋亡过程中起着重要作用。

在肿瘤细胞中，Fas/FasL系统有调控细胞凋亡的作用，已成为肿瘤免疫治疗研究的热点。研究证实［9，10］，在多种恶性肿瘤细胞中，Fas表达下降，FasL表达上调，使得淋巴细胞无法识别并激活肿瘤细胞表面的Fas，相反，恶性肿瘤细胞表达的FasL可识别并激活淋巴细胞表面的Fas启动凋亡程序。本实验亦观察到胃癌细胞高表达FasL，提示胃癌细胞可能是通过高表达FasL介导逃避机体的免疫监视。

RNAi的出现可以沉默胃癌细胞的FasL基因，下调胃癌细胞FasL的产生，或诱导Fas蛋白的高表达，消除或减弱肿瘤细胞对机体活性淋巴细胞的诱导凋亡作用，从而使机体对肿瘤的杀伤免疫潜能被激活。已有学者成功应用RNAi调控肿瘤细胞的FasL表达并促进细胞凋亡［11］。本实验我们用RNAi处理后的胃癌细胞，检测FasL⁃mRNA量较处理前下降，说明导入的FasL⁃siRNA能够抑制胃癌细胞表达FasL，在与肿瘤特异性CTL共培养后，胃癌细胞凋亡增加，证实应用RNAi能使胃癌细胞FasL表达下降，并使其不能识别激活CTL表面的 Fas配体，这与Toshiki等［12］学者研究结果一致，且侵袭试验亦显示RNA干扰沉默降低了胃癌细胞的侵袭能力。

现阶段对于siRNA的传递和导入方法仍需要进一步改善，对于多个siRNA同时导入体内或siR⁃NA与化疗药物同时导入体内产生的影响还需进一步研究。本实验只在体外验证RNAi能干扰胃癌细胞表达FasL，并使其不能逃避肿瘤特异性CTL的免疫清除，尚未在动物实验体内种植RNAi处理的胃癌细胞并跟踪其生长、浸润情况。因此，有关肿瘤细胞与免疫清除的相互作用仍需要后续进一步研究。