FOS样抗原1在头颈鳞癌中的表达及临床意义

高晓琳，修霞，邱萍萍，张杜合一，谢舒乐，林钊宇

头颈鳞癌（head and neck squamous cell carci⁃noma，HNSC）位于全球最常见恶性肿瘤的第八位，每年新发病例超过55万［1］。HNSC具有局部复发率高，易发生淋巴结转移等特点，临床治疗多采用以手术为主，辅以放化疗或免疫疗法，然而头颈鳞癌患者的5年生存率仍低于50%［2，3］。FOS样抗原1（FOS⁃like antigen 1，FOSL1）是FOS家族蛋白的成员，FOSL1和JunB家族蛋白形成异质二聚体，共同组成肿瘤内重要的转录因子——活化蛋白⁃1（activator protein⁃1，AP⁃1）［4］。目前研究证实FOSL1具有多种功能，如沉默FOSL1抑制了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭；FOSL1抑制了Ⅰ型干扰素对疟疾和病毒感染的反应［5，6］。然而，关于FOSL1蛋白在头颈鳞癌中的表达及其作用的报道尚未发现。本研究通过查询数据库及免疫组化等方法检测FOSL1在头颈鳞癌患者的表达水平，并分析其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科2010年3月至2014年8月根治性手术切除的头颈鳞癌及其癌旁组织共98例。所有头颈鳞癌患者术前均未接受放疗或化疗等治疗。所有标本用4%多聚甲醛固定和石蜡包埋后制备4μm切片。所有患者均已被告知并签署由本院伦理委员会批准的知情同意书。

1.2 UALCAN数据库分析

通过UALCAN数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html/）获取FOSL1基因在头颈鳞癌内的表达及预后情况，通过Expression选项中sample type、tumor grade、gender等分类预测FOSL1在HNSC中的表达情况；通过Survival模式，以中位数为cut⁃off，预测FOSL1表达与HNSC患者的生存曲线图。

1.3 免疫组化

二甲苯及梯度酒精常规脱蜡，pH6.0枸橼酸微波修复20 min，自然冷却至室温。3%H2O2避光孵育15 min，滴加FOSL1一抗（Santa Cruz公司，sc⁃28310，1∶500）4℃孵育过夜，PBS漂洗后滴加抗鼠IgG二抗（基因科技公司，GK500710）37℃孵育30 min，PBS漂洗后滴加DAB显色剂，苏木素染核，脱水后树胶封片。光学显微镜下观察结果FOSL1的表达情况。

1.4 免疫组化结果评判

FOSL1的表达主要位于细胞核内，在高倍镜下随机选取5个视野，计算阳性细胞的百分比：0分是阳性细胞数＜5%，1分是阳性表达细胞数5%～24%，2分是阳性表达细胞数为25%～49%，3分是阳性表达细胞数为50%～74%，4分是阳性表达细胞数≥75%；同时评判染色深度：0分是不着色，1分是淡黄色，2分是棕黄色，3分是棕褐色。最后两项得分相乘，0～3分的标本判定为低表达，4～12分的标本判断为高表达。

1.5 统计学方法

应用SPSS 20.0统计软件，分析FOSL1蛋白表达与患者临床病理指标之间的关系采用卡方检验。采用Kaplan⁃Meier法进行生存分析，绘制生存曲线。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UALCAN数据库获取FOSL1在头颈鳞癌中的表达

通过UALCAN数据库，我们基于sample type、tumor grade、HPV status和nodal metastasis status等分类对比了FOSL1在HNSC组织的表达。我们发现FOSL1在头颈鳞癌中的表达显著高于癌旁组织（P=0.039）（图1A）。其次，不同病理分级HNSC中FOSL1的表达均比癌旁组织高，其中Grade 2（intermediate grade）和Grade 4（high grade）HNSC中FOSL1显著升高（P＜0.001）。不同病理分级HNSC组织内FOSL1的表达呈显著差异：Grade 1⁃vs⁃Grade 2（P=0.032），Grade 1⁃vs⁃Grade 4（P＜0.0001），Grade 2⁃vs⁃Grade 3（P=0.0106），Grade 2⁃vs⁃Grade 4（P＜0.0001），Grade 3⁃vs⁃Grade 4（P＜0.0001）（图 1B）。HPV阳性HNSC患者（p16&ISH检测）中FOSL1的表达显著低于HPV阴性患者（P＜0.001）（图1C）。此外，数据显示与无淋巴结转移的患者（N0）相比，仅有N3组HNSC患者（＞10个淋巴结转移）中FOSL1表达显著升高（P=0.0017），而N1组较N3组亦显著升高（P=0.0012）（图1D）。

2.2 免疫组化检测FOSL1蛋白在头颈鳞癌标本中的表达

我们发现FOSL1蛋白主要定位于细胞核内。FOSL1在癌旁组织内的阳性率仅为8.1%（8/98），且FOSL1表达呈弱阳性，而大部分癌旁组织FOSL1表达为阴性。然而FOSL1在头颈鳞癌样本中均有表达，其中54例（55.1%）头颈鳞癌FOSL1呈高表达（强阳性），44例（44.9%）头颈鳞癌FOSL1呈低表达（弱阳性）（图2A～D）。

图1 UALCAN数据库检测FOSL1蛋白在HNSC中的表达

图2 头颈鳞癌及癌旁组织内FOSL1的表达（免疫组化，×200）

2.3 FOSL1的表达与头颈鳞癌患者临床病理指标的关系

FOSL1表达与肿瘤的大小、淋巴结转移、临床分期及病理分化程度显著相关（P＜0.05），即高表达FOSL1的头颈鳞癌患者的肿瘤直径更大、分化程度更差、临床分级更高，易发生区域性淋巴结转移。而FOSL1表达水平与患者性别、年龄、远处转移等指标无明显相关性（P＞0.05），结果见表1。

2.4 FOSL1 的表达对头颈鳞癌患者预后的影响

UALCAN数据库显示高表达FOSL1的HNSC患者较低表达HNSC预后差，两组之间具有显著差异（P=0.035）（图3A）。此外，我们通过Kaplan⁃Meier法分析FOSL1表达对98例HNSC患者（本院收集）预后的影响。结果发现其中FOSL1低表达组的头颈鳞癌患者中位生存时间为96个月，FOSL1高表达组的头颈鳞癌患者中位生存时间为42个月，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3B。

3 讨论

目前AP⁃1蛋白被认为调控肿瘤、哮喘和类风湿性关节炎等多种疾病的关键转录因子，它会响应细胞因子、激素和生长因子等各种外界刺激，调控下游基因的表达继而影响细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程［7，8］。AP⁃1是一种由Jun家族蛋白和Fos家族蛋白形成的高度保守的同源或者异源二聚体复合物，其中FOSL1属于FOS蛋白家族的一员，它与Jun家族蛋白形成异源二聚体是众多AP⁃1 复合物中最为稳定的［8，9］。研究表明，AP⁃1主要通过FOSL1调控基质金属蛋白酶家族降解细胞外基质，进而肿瘤的转移和侵袭［7，8］。例如，在人结直肠癌细胞HT⁃29中AP⁃1结合在MMP7的DNA启动子区，促进肠癌的转移和侵袭［10］。此外，FOSL1的调控作用发生在转录和翻译后修饰的水平，而蛋白水平的磷酸化是FOSL1调控翻译后修饰的主要方式［8-10］。FOSL1主要由丝裂原活化蛋白激酶信号途径调控，并被泛素非依赖性蛋白酶体降解［11］。此外，FOSL1可影响肿瘤的增殖、分化、侵袭和凋亡等生物学功能［4-6，11，12］。研究表明，FOSL1在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、鼻咽癌等肿瘤中过表达，而在宫颈癌和卵巢癌中的表达降低，在头颈鳞癌中的表达仍存在争议［11⁃14］。

表1 FOSL1蛋白表达与头颈鳞癌临床病理特征的相关性（n）

图3 FOSL1的表达与头颈鳞癌患者的预后

目前生物大数据库在细胞生物学的研究中发挥了举足轻重的作用，UALCAN整合了TCGA和MET500来源的数据，用于比较某一基因在特定肿瘤和正常组织、不同病理分类的肿瘤之间和不同类型正常组织内的表达情况，同时还可以基因间的共表达分析、药物敏感性基因筛查等［15］。本实验中我们发现FOSL1在头颈鳞癌中显著高表达，且FOSL1高表达与HNSC患者预后差显著相关（P＜0.05）。此外，FOSL1的表达与HNSC患者的病理分级、淋巴结转移和HPV状态密切相关（P＜0.05）。

随后我们通过免疫组化验证FOSL1蛋白在头颈鳞癌及癌旁组织中的表达情况。结果发现FOSL1在绝大多数头颈鳞癌中均有表达，且头颈鳞癌组织中FOSL1的表达显著高于癌旁组织。通过卡方检验分析，我们发现FOSL1的表达与肿瘤的大小、淋巴结转移、HPV状态及病理分化程度显著相关（P＜0.05）。Kaplan⁃Meier分析表明高表达FOSL1的头颈鳞癌患者生存率明显低于低表达FOSL1的头颈鳞癌患者。以上结果与数据库预测的结果基本一致。本研究显示FOSL1蛋白在头颈鳞癌中显著上调，且与头颈鳞患者临床特征及预后密切相关，提示FOSL1可能在头颈鳞癌的发生发展过程中起到重要作用，它可以作为评估头颈鳞癌患者预后的指标。