酵母产品对凡纳滨对虾的诱食效果及生长性能的影响

2020-07-04陈晓瑛王国霞孙育平宋宏斌黄燕华曹俊明

饲料工业 2020年12期

陈晓瑛王国霞邹青孙育平宋宏斌黄燕华* 曹俊明

（1.广东省农业科学院动物科学研究所农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东广州510640；2.广州飞禧特生物科技有限公司，广东广州510640；3.广东海纳川生物科技股份有限公司，广东佛山528500）

鱼粉作为水产动物理想蛋白源，近年来自然环境恶化及集约化规模化养殖盛行，人工配合饲料的需求量不断增加，鱼粉需求量和价格不断上升。解决方法除了优化配方外，开发新的动植物蛋白源替代品也是必然趋势。但是饲料中添加动植物蛋白源会造成饲料适口性差、水产动物摄食不完全、生长缓慢、环境污染等问题。众多学者和专家认为解决这些问题的有效手段是在饲料中添加诱食剂，所以寻找合适的促摄食物质是研究的热点。现已发现促摄食物质包括天然的动物提取物（虾蟹粉、乌贼膏、鱼粉、蚕蛹、蚯蚓等）、天然植物提取物（中草药、海藻、丁香等）、氨基酸类（色氨酸、牛磺酸）、核苷酸类、甜菜碱类化合物及复合型促摄食物质等。对于大多数的水产动物而言，多种促摄食物质复合使用的效果往往比单一促摄食物质效果更好[1]，这可能是由于单一促摄食物质只能对水产动物的视觉、嗅觉或者味觉的某个作用位点作用，而复合促摄食物质则形成的综合作用，效果更为明显。酵母细胞富含丰富的营养物质：蛋白质、氨基酸、小肽、维生素、矿物质、β-葡聚糖、甘露寡糖、谷胱甘肽、核苷酸等。2013年12月酵母源产品（酵母水解物、酵母细胞壁、酵母粉等）被列入《饲料原料目录》，丰富国内饲用原料的选择。所以研究酵母类产品的促摄食功能具有重要意义。已有研究发现酵母类产品在中华鳖(Pelodiscus sinensis)[2]、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）[3]、异育银鲫(Carassius auratus gibelio)[4]、杂交鳢(Channa spp.)[5]等具有促进摄食的作用。

凡纳滨对虾是世界三大对虾之一，是我国对虾的主导养殖品种和重要出口水产品，近年来对虾摄食减少、生长减慢、病害频发，严重制约着对虾产业可持续发展。本试验通过比较凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）对3 种酵母产品（酵母核苷酸、鲜酵母粉、啤酒酵母水解物）的选食偏好，筛选出诱食效果最佳的酵母产品，并研究其在2个蛋白水平下对凡纳滨对虾生长性能的影响。已有酵母培养物[6]、酵母水解物[7]、酵母蛋白水解物[8]和酵母提取物[9]对凡纳滨对虾生长性能和非特异性免疫的影响的文献。而通过比较几种复合诱食剂对凡纳滨对虾的诱食效果，并在不同蛋白水平下添加复合诱食剂对水产动物生长性能的影响尚未见报道。本试验结果将丰富酵母产品对甲壳动物诱食效果的研究，并为酵母产品在对虾养殖生产应用中提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲜酵母粉、酵母核苷酸和啤酒酵母水解物均由广东海纳川生物科技股份有限公司提供。其营养组成见表1。

表1 3种酵母产品的营养组成（风干基础，%）

1.2 试验饲料

1.2.1 诱食饲料

试验基础饲料以秘鲁鱼粉、国产鱼粉、豆粕、花生麸、虾壳粉为蛋白源，以鱼油和磷脂油为脂肪源，面粉为糖源配制成鱼粉料。试验饲料将3%秘鲁鱼粉替换为3%鲜酵母粉、3%酵母核苷酸、3%啤酒酵母水解物。每种饲料分别对应一种标记物，鱼粉组饲料对应氧化钇（Y2O3）、鲜酵母粉组对应氧化钕（Nd2O3）、酵母核苷酸组对应氧化镧（La2O3）和啤酒酵母水解物对应氧化镱（Yb2O3）。基础饲料组成见表2，各组的营养水平见表3。

1.2.2 生长饲料

以秘鲁鱼粉、国产鱼粉、虾壳粉、豆粕、大豆浓缩蛋白、血粉、花生麸为主要蛋白源，鱼油、大豆磷脂油为主要脂肪源，面粉为糖源，通过调整大豆浓缩蛋白、血粉、豆粕、花生麸和面粉配制36.00%和45.27% 2个高低蛋白水平的基础饲料，记为D0 和G0，其配方和营养水平如表4 所示。在高低蛋白水平的基础组饲料中分别添加酵母核苷酸8 g∕kg，分别记为Dy、Gy。

表2 诱食饲料（鱼粉组）组成（风干基础，%）

表3 各组诱食饲料营养水平（风干基础，%）

两个养殖试验的饲料原料过60 目筛后混合均匀，用SLX-80 型双螺杆挤压机制成直径为1 mm，长度为3 mm 的颗粒饲料，在50 ℃烘箱中烘干，自然冷却后放入密封袋中，-20 ℃冰箱中保存待用。

1.3 试验虾与饲养管理

试验用凡纳滨对虾购自海大集团有限公司番禺种苗场。饲养试验前，将对虾放入暂养系统投喂基础饲料驯养2 周。诱食和生长试验均在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究室的室内循环水养殖系统中进行。玻璃纤维桶容积为350 L（直径80 cm，高70 cm，水体容积300 L），进水速率为3.2～3.5 L∕min。

1.3.1 诱食试验

挑选体质量约7.5 g 凡纳滨对虾80 尾，随机分成4组，每个重复20尾虾。为了检测出试验虾对每种诱食物质的不同浓度的选食偏好，每天投喂前将4种不同标记饲料混匀（每种饲料10 g），过量投喂给试验虾。试验虾每天投喂3次，分别在8:00、14:00和20:00，每次投喂停水停气。投喂30 min后收集残饵。每天观察对虾健康状况，记录死亡情况。饲养试验开始1周后收集粪便，投饲2 h 后用虹吸管和捞网收集粪便，60 ℃烘干，-20 ℃冰箱中保存备用。试验水源为海水和已曝气自来水混合后的咸淡水，经过沙滤、消毒后添入，盐度为3.0～5.0，自然光照，水温28.5～32.0 ℃，pH值7.8～8.0，溶氧＞6.0 mg∕l，氨氮≤0.1 mg∕l，亚硝酸盐≤0.01 mg∕l。饲养周期28 d。饲养试验结束后，计算每桶对虾数量，各组对虾的存活率在90%～100%之间。

表4 生长基础饲料配方组成及营养水平（风干基础，%）

1.3.2 生长试验

挑选体质量约(0.79±0.01) g 的凡纳滨对虾苗480尾，随机分为4 组，每组4 个重复，每个重复30 尾虾，分别投喂4种生长试验饲料。采用饱食投喂法，每天在8:30、14:30和20:30分三次投喂，投喂量为体重的4%～6%，饲喂后30 min吸出残饵，同时根据摄食情况及时调整投饲量。每天观察对虾健康状况，记录死亡情况。养殖周期56 d。试验水源为海水和已曝气自来水混合后的咸淡水，经过沙滤、消毒后添入，盐度为4.0～5.0，自然光照，水温20～26 ℃，pH 值7.0～8.0，溶氧＞6.0 mg∕l，氨氮浓度≤0.1 mg∕l，亚硝酸盐浓度≤0.01 mg∕l。

1.4 样品采集、指标测定及计算公式

1.4.1 样品采集

生长试验结束时，禁食12 h，称终末体质量，统计对虾存活尾数，计算试验虾增重率（WGR）、特定生长率（SGR）、摄食量（FI）、饲料系数（FC）和存活率（SR）。每个重复随机选取8 尾虾用于测定全虾干物质、粗蛋白、粗脂肪和灰分。每个重复随机取5 尾测定肝体比（HSI）和肥满度（CF）。

1.4.2 常规营养成分和惰性元素测定方法

采用105 ℃烘箱干燥法（GB∕T 6435—2014）、凯氏定氮法（GB∕T 6432—1994）、索氏抽提法（GB∕T 6433—2006）、550 ℃灼烧法（GB∕T 6438—2008）分别测定全虾水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分。饲料和粪便的惰性元素分析委托中国广州分析测试中心通过等离子发光色谱（ICP-MS）测定。

1.4.3 诱食效果和生长计算公式

选食偏好[10]以粪便中的某一惰性元素的相对含量来表示：

第i 种饲料摄食偏好=（粪便中惰性标记物i 的含量∕粪便中所有惰性标记物的总量）∕（饲料中惰性标记物i的含量∕混合投喂饲料中所有惰性标记物的总量）

存活率（SR，%）=（试验结束时虾尾数∕试验开始时放虾尾数）×100增重率(WGR，%)=(末均重-初均重)×100∕初均重特定生长率（SGR，%∕d）=[ln（末均重）-ln（初均重）]×100∕饲养天数

饲料系数（FC）=摄食量∕（终末虾体重+试验中死亡虾体重-初始虾体重）

肝体比（HSI，%）=（肝胰腺重∕体重）×100

肥满度(CF，g∕cm3)=100×每尾虾体重(g)∕[每尾虾体长(cm)]3

摄食量（FI，g）=投饵总量∕[（试验开始时放虾尾数+试验结束时虾尾数）∕2]

蛋白质保留率（PDR，%）=100×（试验终末虾体蛋白含量-试验初始虾体蛋白含量）∕摄入蛋白量

1.5 数据计算与统计分析

数据采用“平均数±标准误（M±SE）”表示。采用SPSS17.0软件进行数据分析和统计，选食偏好进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。若处理间差异显著，再用Duncan's 法多重比较，差异显著水平为P＜0.05。生长试验数据通过双因素方差分析，利用Duncan's 法多重比较组间显著差异分析，差异显著水平为P＜0.05，差异极显著水平为P＜0.01。

2 试验结果与分析

2.1 凡纳滨对虾对不同饲料的选食偏好(见表5)

表5 凡纳滨对虾对不同饲料的选食偏好

由表5可知，凡纳滨对虾对不同饲料的选食偏好高低为酵母核苷酸组＞鲜酵母粉组＞鱼粉组＞啤酒酵母水解物组，且各组间差异显著（P＜0.05）。说明饲料中添加酵母核苷酸对凡纳滨对虾的诱食效果最佳，显著高于其他各组；鲜酵母粉组的诱食作用显著低于酵母核苷酸组（P＜0.05），但是显著高于鱼粉组（P＜0.05）；而添加啤酒酵母水解物的饲料选食偏好最低，显著低于其他各组（P＜0.05）。

2.2 2 种蛋白水平饲料中添加酵母核苷酸对凡纳滨对虾存活率和生长性能的影响(见表6)

由表6可知，蛋白水平对存活率、终末体均质量影响极显著（P＜0.01），低蛋白水平的存活率和终末体均质量极显著高于高蛋白水平16.88%和26.80%（P＜0.01）。蛋白水平对增重率和特定生长率影响显著（P＜0.05），低蛋白水平的增重率、特定生长率显著高于高蛋白15.04%和6.94%（P＜0.05）。饲料中添加酵母核苷酸能极显著提高对虾存活率（P＜0.01），同一蛋白水平下添加酵母核苷酸能提高对虾终末体均质量、增重率和特定生长率(P＞0.05)。双因素在存活率和终末体质量有显著的互作效应(P＜0.05)。单因素和双因素对对虾饲料系数无显著性影响，其中低蛋白中添加酵母核苷酸的饲料系数显著低于高蛋白中添加酵母核苷酸，与高低蛋白基础组无显著性差异。其中DY组的存活率、终末体均质量、增重率、特定生长率均为最大值，饲料系数为最小值。

2.3 2 种蛋白水平饲料中添加酵母核苷酸对凡纳滨对虾形体指标及饲料利用的影响(见表7)

由表7可知，单因素和双因素对对虾肝体比和肥满度的影响均不显著（P＞0.05）。低蛋白水平的对虾摄食量和蛋白质保留率极显著高于高蛋白水平（P＜0.01）。低蛋白水平添加酵母核苷酸组的摄食量和蛋白质保留率最高，显著高于高蛋白水平组（P＜0.05）。双因素在摄食量和蛋白质保留率无显著交互效应（P＞0.05）。2.4 2 种蛋白水平饲料中添加酵母核苷酸对全虾体组成的影响(见表8)

由表8可知，蛋白水平对全虾体组成影响不显著（P＞0.05）。饲料中添加酵母核苷酸能显著提高全虾粗脂肪含量（P＜0.05），对干物质、粗蛋白质和灰分影响不显著（P＞0.05）。双因素在全虾干物质、粗蛋白质、粗脂肪和灰分的无显著的交互效应（P＞0.05）。

表6 2种蛋白水平饲料中添加酵母核苷酸对凡纳滨对虾生长性能的影响

表7 2种蛋白水平饲料中添加酵母核苷酸对凡纳滨对虾形体指标和饲料利用情况的影响

表8 2种蛋白水平饲料中添加酵母核苷酸对凡纳滨对虾体成分的影响（干重，%）

3 讨论

3.1 酵母产品对凡纳滨对虾诱食效果的影响

目前，对水产动物诱食剂的筛选方法主要有电生理学法、摄食行为学法和摄食量法。电生理学法是通过电生理仪器记录不同促摄食物质的浓度阈值，但是对于刺激物能否提高摄食并不明确。摄食行为学法研究的是动物瞬时或者短期行为，没有得到这些化学物质对摄食活动的直接影响的数据，结果不够准确[11]。摄食量法采用精准的摄食量为指标，是相对有效的研究方法。但是摄食量法耗时长，不能在短时间内进行大批的可能具有促摄食潜力的物质进行筛选。本研究通过惰性标记物标记不同的饲料，对粪便中不同标记物的相对含量进行检测，得出摄食偏好。该方法是由Refstie 等[12]提出，由Xue 等[10]改进。其最大的优势是在不影响水产动物正常摄食情况下，在一组处理中检测多种饲料的摄食偏好，大大减少工作量。Xue等[10]研究6种促摄食物质对异育银鲫的摄食偏好，发现合成乌贼提取物的诱食效果最为明显。尹子煜等[4]研究了酵母提取物在异育银鲫饲料中促摄食作用，高鱼粉水平下，酵母提取物能显著提高异育银鲫的选食偏好；低鱼粉水平下，高水平的酵母提取物才能显著提高其选食偏好。本研究室邹青[13]研究了7 种促摄食物质在吉富罗非鱼高植物蛋白饲料中的偏好适宜添加量。该方法也被用于检测饲料水分和粒径的适口性[14-15]，受到饲料企业的青睐。

本试验结果表明凡纳滨对虾对酵母核苷酸和鲜酵母粉饲料的选食偏好显著高于鱼粉组。酵母细胞富含丰富的营养物质，包括蛋白质、氨基酸、脂肪、维生素、矿物质，还含有具有生物活性的功能物质：功能性多糖、生物酶、谷胱甘肽、核苷酸等。已有许多研究发现，氨基酸[16-17]和核苷酸[18-21]能有效促进水产动物摄食。酵母水解物是以酿酒酵母发酵，再经过自溶或者外源酶作用下进行水解，浓缩或干燥获得的产品，其中的酵母可溶物未经提取，保留了完整的细胞质营养，富含蛋白、核苷酸、小肽、游离氨基酸和B 族维生素，营养吸收利用好。国际水解蛋白委员会（1977）关于酵母水解物（自溶酵母抽提物）的定义是全世界用作天然食品调味料的食品配料。本试验中的酵母核苷酸是一种酵母水解物，通过核酸水解鲜酵母而制得，其核苷酸含量为6.02%以上，且游离氨基酸高达7.1%。本试验结果显示凡纳滨对虾对酵母核苷酸的选食偏好显著高于其他各组，这应该与酵母核苷酸中较高含量核苷酸和游离氨基酸有关。现如今酵母粉主要用于替代鱼粉，有研究发现饲料中使用酵母粉替代鱼粉对海鲈（Dicentrarchus labrax）[22]、大菱鲆[23]、草鱼(Grass carp)[24]等水产动物的饲料利用及生长性能无显著性影响。而关于对水产动物的选食偏好的研究尚未见报道。本试验中的鲜酵母粉是未破壁的酵母细胞直接干燥制得，凡纳滨对虾对其的选食偏好显著高于鱼粉组和啤酒酵母水解物组，显著低于酵母核苷酸组。鲜酵母粉的氨基酸含量为44.68%，低于酵母核苷酸的47.08%，但却高于啤酒酵母水解物的31.99%。鲜酵母粉的诱食作用是否与其氨基酸含量有关？另外尹子煜等[4]发现饲料中的鱼粉含量会影响其诱食剂的使用量，本试验酵母产品诱食饲料中的鱼粉含量为19%，是否与饲料中鱼粉的含量有关？同时酵母的来源和组成、养殖的对象、规格等都可能影响其诱食效果，其具体的作用机制有待进一步研究。有研究发现饲料中添加啤酒酵母水解物对草鱼的摄食量和生长性能无显著性影响[25]。而在本试验中凡纳滨对虾对同为酵母水解物的啤酒酵母水解物的选食偏好最差，显著低于其他各组。这可能是由于啤酒酵母水解物中含带有苦涩味的酒花，抑制对虾的摄食，具体原因还需做进一步分析。

3.2 酵母核苷酸在不同蛋白水平饲料下对凡纳滨对虾生长性能的影响

本试验结果显示，与高蛋白水平相比，低蛋白水平能显著提高凡纳滨对虾的终末体均质量、增重率、特定生长率、摄食量和蛋白质保留率。裘金木等[26]发现，相比于高蛋白质水平（40.79%），低蛋白水平（37.01%）能显著提高凡纳滨对虾幼虾的蛋白质效率，提高其增重率、特定生长率和摄食量。虞冰如等[27]研究发现，饲料中蛋白质含量的不同对日本沼虾（Macrobrachium nipponensis）生长有影响，虾体增重率随着饲料中蛋白质水平的升高呈现先升高后降低的趋势。而熊益民[28]在研究高盐度下，凡纳滨对虾对低鱼粉饲料中的蛋白质和脂肪需求，发现同一脂肪水平下蛋白含量高对对虾生长有一定的促进作用，在39%蛋白、8%脂肪的实验组拥有较高的特定生长率和增重率。马永萍等[29]发现，高蛋白水平（43.6%）组凡纳滨对虾的终末体质量、增重率和特定生长率显著高于低蛋白水平（40.8%）组。而吴锐全等[30]研究发现，随着饲料中蛋白质含量的升高，罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）的增重率呈现先上升后达到较为恒定的值，而饵料系数则呈现先下降，当蛋白质水平超过39.27%时，随着饲料蛋白质含量的继续增加，饵料系数反而呈现略微上升的趋势。不同的试验导致试验结果差异的原因可能是由于养殖对象的生长阶段、蛋白质来源及品质、蛋白质消化率以及饲养环境等不同造成的。另外更重要的原因可能与凡纳滨对虾的蛋白质需求量有关，Pedrazzoli等[31]发现凡纳滨对虾蛋白质需求量在35%～40%范围内。Smith 等[32]发现，半精制饲料研究了在海水中凡纳滨对虾幼虾的蛋白质最适需求量为37.6%。笔者推测36%蛋白水平是凡纳滨对虾较适宜需求量，而45.27%蛋白水平高于凡纳滨对虾的需求量，所以36%蛋白水平能显著影响对虾的生长性能。但也有其他学者在不同的实验条件下发现凡纳滨对虾的蛋白质需求量在其他范围[33-34]，所以尚需进一步验证。熊益民[28]研究发现，在8%脂肪水平下，35%蛋白水平的凡纳滨对虾存活率显著高于41%蛋白水平。有研究发现不同饲料蛋白水平对斑节对虾家系[35]和日本沼虾[36]存活率，随着饲料蛋白含量的增加呈现先上升后下降的趋势，分别在38%和39.32%蛋白水平达到最大值。而申玉春等[37]发现饲料中的蛋白水平对对虾存活率影响不显著。但是，本试验中饲喂低蛋白水平饲料的凡纳滨对虾的存活率极显著高于高蛋白水平组。这是否与高蛋白组对凡纳滨对虾机体产生胁迫，显著影响了对虾的生长，尚需做进一步分析。

已有研究发现饲料中添加酵母类产品能促进水产动物的生长。熊家等[38]在饲料中添加酵母水解物对凡纳滨对虾的影响，发现饲料中添加1%的酵母水解物对凡纳滨对虾的增重率、特定生长率有增高趋势，但差异不显著。而当添加比例为3%～5%时能有效改善凡纳滨对虾生长性能、提高饲料利用率。何远法等[6]研究发现饲料中添加0.3%酵母培养物能显著提高凡纳滨对虾的摄食率，提高凡纳滨对虾的增重率、特定生长率、蛋白质效率，降低饵料系数。赵贵萍[39]研究不同豆粕水平饲料中添加适量的益康XP（酵母培养物）能提高大菱鲆的摄食量、特定生长率、蛋白质效率、饲料效率。郑银桦等[40]发现饲料中添加3%的酵母酶解物能显著提高大口黑鲈（Micropterus salmoides）的摄食率和生长性能。陈昌福等[2]发现饲料中添加适量的酵母水解物，能促进中华鳖成鳖的采食量，加快其对饵料的采食速度。张婷婷[8]研究发现，饲料中添加1%或2%酵母蛋白水解物可显著提高凡纳滨对虾的摄食率，但对其生长无显著性影响。饲料中添加BGB 破壁酵母粉对中华绒螯蟹具有较好的诱食效果[3]。尹子煜等[4]研究发现，酵母提取物能促进异育银鲫的摄食。郑晶等[5]研究4种诱食剂对杂交鳢生长和血清生化指标的影响，发现酵母膏和复合诱食剂能促进杂交鳢的摄食，显著促进其生长。本试验结果也有类似的效果，在不同蛋白水平饲料中添加0.8%酵母核苷酸，提高对虾的末均重、增重率、特定生长率、摄食量和蛋白质保留率。这应该与酵母核苷酸内含有的高比例的核苷酸和甘露寡糖有一定的关系。饲料中添加适量的外源核苷酸能提高点带石斑鱼[41]（Epinephelus malabaricus）、大西洋鲑[42]（Salmo salar）、鲤鱼[43]（Cyprinus carpio）、锦鲤[44]（Brocarded carp）幼鱼、凡纳滨对虾[20]的增重率和特定生长率，降低饲料系数。Li等[45]报道，核苷酸促进生长的机制可能是通过促进提高水产动物的摄食速率，减少饲料中营养物质的溶失，更多用于体内的代谢过程。而甘露寡糖促进生长的机制则被认为是通过寡糖的特性改善水产动物的肠道功能进行[46-47]。有研究发现[7]，凡纳滨对虾血清甘油三酯随着饲料酵母水解物水平的升高呈上升的趋势，酵母水解物影响了机体的脂类运输。酵母水解物中富含有较高的核苷酸。外源核苷酸能显著提高凡纳滨对虾全虾粗脂肪含量[20]。本试验结果也有类似结果。这可能与外源核苷酸能影响机体某些组织脂类蛋白或者不饱和脂肪酸的代谢[48]，但具体作用机理尚未见报道，需进一步深入研究。