利用沙棘果渣固态发酵生产新型绿色生物饲料的研究

王艳华 池景良 钟丽娟

（辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳122000）

沙棘又名醋柳、酸刺、黑刺，沙棘属落叶灌木或小乔木。茎、叶、花、果均具珍贵的经济价值[1]。由于其含有丰富的维生素、多糖、蛋白质、氨基酸、微量元素等营养成分以及黄酮类、甾体类化合物、原花青素、三萜烯类、鞣质、5-羟色胺等生物活性物质,具备药食同源的特性，在保健品、食品等开发研究方面得到广泛重视[2-4]。

随着沙棘加工产业的发展，沙棘果渣大量产生，极少部分直接进行了动物饲喂，绝大部分直接丢弃没有充分利用。

沙棘果渣是沙棘果榨汁后的残渣，约占沙棘果鲜重的20%，在动物营养、抗氧化和免疫方面有极大的利用价值[5]。沙棘果渣有两种，一种是沙棘鲜果榨汁后剔除果核(种子)的果肉果皮残渣;一种是沙棘种子提取沙棘油后的残渣。经研究表明，沙棘果渣中依旧含有多种必需氨基酸和微量元素，黄酮的含量甚至会高过沙棘汁和沙棘油中的黄酮[6-7]。黄酮类化合物是一种很有效的活性氧清除剂和脂质抗氧化剂，具有较强清除自由基的能力，能有效地清除超氧阴离子和羟自由基，因而有很好的抗衰老功能[8-9]。

沙棘果渣中含有丰富的黄酮、维生素B1、维生素B2、维生素C、维生素E、氨基酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、鞣质、糖、三萜及甾体类等成分[10-13]。国内外大量试验证明，在鸡、猪、牛、羊、兔等畜禽的饲料中加入一定数量的沙棘果渣，可以促进生长，降低发病率，提高肉或蛋的品质，又可以降低饲料成本，是优质而且价格低廉的饲料[14-17]。沙棘果渣长期饲喂动物安全可靠，无蓄积性毒害，对畜禽的生长、生产性能具有不同程度的促进作用，提高饲料利用率和蛋黄胡萝卜素含量，并有降低胆固醇，促进免疫器官生长发育，提高机体抗病力的作用，是畜禽极其理想，价廉质优的添加饲料。利用沙棘制品残渣作为补充饲料，既增加了优质饲料来源，提高了乳、肉、蛋品的数量和质量，又有益于公共卫生，具有显著的生产效益和社会效益[18]。

本实验利用固态生物发酵技术，采用地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母、白地霉三株菌株混菌发酵，对沙棘果渣进行固态发酵生产生物饲料的研究，发挥多菌株间的协同作用，降解了果渣本身含有的果胶及纤维素等物质，提高了菌体蛋白含量，并具有益生特性，使以沙棘果渣为主料的发酵料兼具微生态制剂与蛋白饲料双重功效的绿色生物饲料。

中国农业农村部第194 号文件规定从2020 年起饲料中全面禁止使用药物饲料添加剂，饲料端全面禁抗开始，含有活菌制剂的生物饲料必将发挥更加重要的作用。利用沙棘果渣为主料发酵生产生物饲料，减少了资源浪费和环境污染问题，拓展了沙棘果渣综合利用的新途径，具有积极的经济及社会效益。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母、白地霉，均来自辽宁省微生物科学研究院菌种保藏中心。

1.1.2 沙棘果渣

辽宁省建平县沙棘制品厂提供，原料分析结果见表1。

从表1 看出沙棘皮渣、籽渣成分含量有一定差异，但总体差异并不显著，一般的生产厂家皮渣、籽渣同时产生，故本实验采用上述2种的等量混合皮渣。

表1 沙棘皮渣、籽渣主要成分分析(%)

1.1.3 培养基

1.1.3.1 试管培养基

地衣芽孢杆菌，编号Y-03。LB 培养基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1 000 ml、琼脂粉15 g，pH值为7.0。产朊假丝酵母，编号B-05。麦芽汁培养基。白地霉，编号S-01。麦芽汁培养基。

1.1.3.2 液体发酵培养基

地衣芽孢杆菌LB培养基（g∕l）：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化钠10 g，pH值为7.0。

产朊假丝酵母YPD 培养基（g∕l）：蛋白胨20 g、酵母浸膏10 g、葡萄糖20 g，pH值为6.5。

白地霉YPD 培养基（g∕l）：蛋白胨20 g、酵母浸膏10 g、葡萄糖20 g，pH值为6.5。

1.1.4 主要设备

SPH-2102 恒温培养摇床、PHS-3C 型酸度计、SPX-450 型恒温培养箱、OLMPUS CX41 显微镜、KDN-08A定氮仪。

1.2 方法

1.2.1 菌种培养方法

1.2.1.1 地衣芽孢杆菌

斜面菌种：35 ℃培养24 h。

液体菌种：装液量为100 ml∕500 ml，35 ℃，160 r∕min摇床培养36 h。

1.2.1.2 产朊假丝酵母

斜面菌种：30 ℃培养48 h。

液体菌种：装液量为100 ml∕500 ml，30 ℃，160 r∕min摇床培养24 h。

1.2.1.3 白地霉

斜面菌种：30 ℃培养48 h。

液体菌种：装液量为100 ml∕500 ml，30 ℃，200 r∕min摇床培养48 h。

1.2.2 沙棘皮渣固体发酵培养方法

将培养好的液体菌种按一定接种量接入配好的固体物料中，加入营养盐，按一定水分含量拌匀，铺于层架的屉层上，培养前期可上盖灭菌的湿纱布，控制环境湿度80%左右，30 ℃恒温恒湿固态培养，每天通风换气2～3次，每次20～30 min。

1.2.3 蛋鸡饲喂实验

1.2.3.1 实验动物和日粮组成

实验选择60周龄海兰褐蛋鸡2 880只，随机分为6 组，每组3 个重复，1 到5 组在基础日粮中分别添加1%、2% 、3%、4%、5%沙棘发酵饲料，对照组饲喂玉米-豆粕型基础日粮；预试期7 d，正式饲喂期35 d，实验期共42 d。基础日粮参照中华人民共和国蛋鸡饲养标准配制，其组成及营养水平见表2。

表2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.2.3.2 饲养管理

采用3 阶梯式笼养，每组又分上中下三层，预试期7 d，按照蛋鸡饲养方法正常管理，自由采食、自由饮水，日投料4次，拣蛋2次。

1.2.3.3 测定项目

分别统计日产蛋率、平均蛋重、蛋黄色泽、破损量、软蛋量、料蛋比、只日采食量等。

1.2.4 测定方法

粗蛋白质测定采用GB∕T 6432—94《饲料中粗蛋白测定方法》，粗纤维测定采用GB∕T 6434—94《饲料中粗纤维含量的测定方法》，粗灰分测定采用GB∕T 6438—92《饲料中粗灰分的测定方法》，粗脂肪测定采用GB∕T 6433—2006《饲料中粗脂肪的测定》，细胞数检测采用生物学活菌计数法，pH值用酸度计测定。蛋黄色泽的测定采用罗氏比色扇比色法（RYCF）。

实验数据的统计分析采用SPSS16.0软件对各组数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 沙棘果渣占整个物料配比的确定

设计沙棘果渣的不同配比，按照合适的发酵碳氮比加入其他辅料，加入定量的液体菌种，30 ℃培养，进行培养情况观察、培养物活菌细胞数及粗蛋白含量检测，结果见表3。

从表3结果可以看出，果渣配比超过70%时物料生长明显变差，说明过高比例的沙棘果渣不利于菌体生长，配比低于40%时生长相对稍差一些，结合细胞数及粗蛋白2 个项目指标，果渣配比占整个物料的40%～70%时最适宜，此时发酵料细胞数及粗蛋白均较高，细胞数最高可达44亿个∕g以上，粗蛋白含量可达39%以上。

2.2 菌种配比对发酵的影响

表3 沙棘果渣占整个物料配比的确定

设计3 个菌种的不同配比，总接种量按10%加入，进行培养情况观察、培养物活菌细胞数及粗蛋白检测，结果见表4。

从表4可以看出，菌种的不同配比及加入量对发酵料的细胞数及粗蛋白有较大的影响，3 个菌种同时加入时，菌体生长最好，三个菌种同时在发酵料中生长，细胞数可达到最大42.61 亿个∕g，粗蛋白可达38%以上。产朊假丝酵母和白地霉对原料无机氮的转化及菌体蛋白的提高有较大的影响，可以促进无机氮转化为有机氮，提高菌体蛋白含量。

表4 菌种配比对发酵的影响

2.3 培养基水分含量对发酵的影响

设计培养物不同的水分含量，进行培养情况观察、培养物活菌细胞数及粗蛋白检测，结果见表5。

从表5可以看出，培养料水分含量为50%～55%时菌体生长情况较好，最适水分含量为55%，此时菌体生长最好，发酵料细胞数及粗蛋白含量均较高。水分含量低于50%时菌体生长变差；高于60%时生长变慢，同时伴随染杂菌现象。

表5 不同水分含量对发酵的影响

2.4 培养料初始pH值的确定

设 计 初 始pH 值 实 验 配 方，用1 mol∕l 的HCl 或1 mol∕l NaOH 调节培养料的起始pH 值，对培养料进行生长情况观察、培养物活菌细胞数及粗蛋白检测，结果见表6。

从表6可知，原料起始pH值对培养的影响较大，最适pH值为4.5～5.0，三个菌种均能生长较好，菌体生长前期既能较快繁殖达到一定菌数，且后期菌体亦生长较好，pH 值为5.0 时细胞数及粗蛋白含量均较高。pH 值较低时菌体生长较慢，细胞数较低，pH 值过高菌体前期生长快，但后期易染杂菌，导致生长变差无法检测。

表6 原料起始pH值对发酵的影响

2.5 接种量的确定

3 个菌种按照同样的比例加入，设计不同的接种总量，对培养料进行生长情况观察及活菌细胞计数，结果见图1。

从图1 可见，随着接种量的增加，发酵料菌体生长速度随之变快，当接种量达到6%时，达到最佳生长状态，细胞数最高可达45 亿个∕g 以上，随着接种量的增加，产品细胞数不再明显增加，物料菌体生长达到稳定状态，由此可以确定接种量6%为最适接种量。

2.6 无机氮源转化率实验

酵母可将培养基中氨态氮的2∕3 转化为蛋白质氮[19]，具有较强的转化无机氮源的能力，以满足菌体生长发育的需要，提高菌体蛋白的含量。本实验以尿素作为无机氮源，其添加量及实验结果见表7。

图1 接种量对培养菌的影响

从表7中可以看出，当尿素添加量为3%时，转化率最高，达86.01%，同时纯蛋白较高，达31.59%，确定尿素添加量为3%时最适宜。

表7 尿素转化率实验(%)

2.7 培养周期的确定

从培养开始，每隔4 h取样一次，测定培养料不同时间的活菌细胞数，见图2。

由图2 可见，随着培养时间的延长，产品细胞数随之增加，至44～48 h 左右时，细胞数相对稳定，可达45 亿个∕g 左右，不再大幅增加，因此培养周期可确定为44～48 h。

图2 细胞数-时间曲线

2.8 对蛋鸡生长性能的影响

在蛋鸡日粮中添加不同比例的发酵沙棘果渣进行饲喂实验，分别统计日产蛋率、平均蛋重、蛋黄色泽、破损量、软蛋量、料蛋比、只日采食量等，实验结果见表8。

表8 发酵饲料对蛋鸡生产性能的影响

从表8可知，配方中加入2%、3%、4%、5%比例发酵沙棘果渣的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组和对照组相比日产蛋率差异显著(P＜0.05)，Ⅳ组日产蛋率最高，比对照组提高6.35%。蛋黄色泽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组和对照组相比差异显著(P＜0.05)，Ⅳ组蛋黄色泽最高，比对照组提高32.27%。破损软蛋率、料蛋比跟对照组相比随着发酵果渣的添加而降低，蛋均重随着发酵果渣添加量的增加而有所提高，但各组间无显著差异(P＞0.05)。只日采食量各组间无显著差异(P＞0.05)。以上数据说明蛋鸡日粮中添加发酵沙棘果渣可以显著改善蛋鸡的生产性能，提高饲料转化率，提高商品蛋的品质，蛋黄颜色加深，其中发酵沙棘果渣添加量为4%时各项数据指标最好。

3 讨论

地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一。2013 年地衣芽孢杆菌被列入到饲料添加剂菌种目录中，是目前市售较集中的饲料中微生态制剂产品之一[20]。地衣芽孢杆菌可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌[21]，达到调整菌群、治疗目的[22-23]。地衣芽孢杆菌芽孢具有极强的抗逆性，能耐受饲料制粒高温、挤压与干燥，以及原料中的无机盐、酸化剂及部分抗生素等因素对其的杀灭作用，故成为饲料与养殖过程中应用最广泛的益生菌之一[24]。

产朊假丝酵母又名产朊圆酵母或食用圆酵母，被美国食品及药物管理局（FDA）认证为可作为食品添加剂的酵母，也是我国卫生部规定的可用于保健食品的真菌菌种[25]。产朊假丝酵母具有较强的转化无机氮为有机氮的能力，并且在其发酵过程中会产生大量的生物活性物质[26]。产朊假丝酵母能够生成富含蛋白质、核苷酸、促生长因子、多种酶类及多族维生素类的菌体蛋白[27]，同时作为一株益生菌，具有调节动物肠道微生态平衡，抑制有害菌生长，促进机体生长的作用。能够刺激反刍动物瘤胃生成大量有益微生物，调控其胃肠菌群环境，增强机体免疫力[28]。

白地霉又叫乳内孢霉，是类似于酵母的地霉属真菌，繁殖力强，对营养要求粗放，细胞较大而易于回收，含50%蛋白质[19]。细胞富含蛋白质、脂肪、维生素和核酸，可作良好的蛋白质饲料[29]。白地霉可以将有机废水废物中的残糖、有机酸、蛋白质、脂肪酸等转化为动物可以吸收利用的单细胞蛋白质，同时其他微生物的加入也可以加速白地霉的转化速率、丰富发酵产品中的营养成分，提升饲料的营养与经济价值[30]。白地霉体内可以合成纤维素酶，可以降解利用饲料原料中的纤维素。

微生物繁殖过程中可产生有机酸（如乳酸），降低果渣pH值，增加果渣酸香味；果渣的微生物发酵过程中，微生物一方面促进饲料中无机氮向有机氮的转化，另一方面也加强了对纤维素、脂肪等营养物质的利用，转化为自身繁殖所需的蛋白质，从而增加果渣中CP 含量[31]。此外沙棘果渣含有较高的黄酮及多酚类抗氧化物质[32]，这使其产品在抗氧化和自由基清除及提高机体免疫力方面能够发挥其更加独有的作用。

本饲喂实验结果表明发酵沙棘果渣能够提高蛋鸡的生产性能，特别是鸡蛋的品质得到了提高，蛋黄颜色明显增加，分析原因是沙棘果渣含有丰富的胡萝卜素和类胡萝卜素，其中萝卜素为15 mg∕kg，类胡萝卜素为70 mg∕kg，还含有沙棘油18%～23%[1]，从而提升了鸡蛋的品质及营养价值。

4 结论

以沙棘果加工副产物的果渣为主料，采用地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母、白地霉三株菌株混菌固态发酵生产生物饲料。其中沙棘果渣配比40%～70%，菌种配比为1∶1∶1，物料含水量55%，初始pH 值4.5～5.0，接种总量6%，无机氮源尿素添加量3%，培养周期为44～48 h。培养物细胞数可达45 亿个∕g 以上，粗蛋白质可达39%以上。

蛋鸡饲喂实验结果表明，蛋鸡日粮中添加发酵沙棘果渣对蛋鸡的生产性能有显著的影响。添加量为4%时，日产蛋率最高，比对照组高6.35%，蛋黄色泽也最高，比对照组高32.27%，和对照组相比均差异显著(P＜0.05)。结果表明蛋均重随着发酵果渣添加量的增加而有所提高，破损软蛋率、料蛋比跟对照组相比随着发酵果渣的添加而降低，但各组间无显著差异(P＞0.05)。以上数据说明蛋鸡日粮中添加发酵沙棘果渣具有较好的饲喂效果，可以显著改善蛋鸡的生产性能，提高饲料转化率，提高商品蛋的品质，其中发酵沙棘果渣添加量为4%时各项数据指标最好。

以沙棘果渣为主料，利用地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母、白地霉三株菌株混菌固态发酵培养生物饲料，采用固态发酵技术法生产，工艺简单可行，操作性强。产品活菌细胞数较高，粗蛋白含量大幅提高。同时沙棘果渣本身丰富的微量元素及维生素等有益成分，使其具有更加独特的饲喂效果，产品兼具微生态制剂及蛋白饲料的双重特性，是一种新型的绿色生物饲料。