血液与尿液中铅形态化合物的HPLC-ICP-MS分析

2020-07-03吴书凡骆如欣张素静马安德

分析测试学报 2020年6期

吴书凡，骆如欣，张素静，马安德，马栋*

(1.南方医科大学公共卫生学院，广东广州 510515；2.司法鉴定科学研究院上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063)

铅是法医毒物分析中关注度较高的无机毒物之一。其在自然界中分布广泛，可在生物体内蓄积，且因其形态不同，毒性差异很大[1]。铅的有机态毒性为无机态毒性的10～100倍,其中，有机铅进入人体后在人体软组织停留时间较长，通过各器官的吸收，可触发癌变。人体内过量沉积铅将导致神经系统的破坏和智力的明显下降[2]。常见的有机铅包括三甲基铅(TML)、三乙基铅(TEL)、四甲基铅和四乙基铅等，其中四甲基铅和四乙基铅不稳定，易降解为毒性更高的TML和TEL。由于四甲基铅和四乙基铅的检测方法已有较多报道，本研究选择TML和TEL进行形态分析。

目前，铅形态的分析方法主要有紫外分光光度法(UV)[3]、原子吸收光谱法(AAS)[4]、质谱法(MS)及各种联用技术，包括气相色谱-原子吸收光谱法(GC-AAS)、气相色谱-原子发射光谱法(GC-AES)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、气相色谱-电感耦合等离子体质谱法(GC-ICP-MS)、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)和毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱法(CE-ICP-MS)等[5-13]。其中，HPLC-ICP-MS因具有接口简单、检出限更低、线性范围更宽、干扰少、前处理过程简便且对待测样品无损等优点而广泛应用于铅形态分析[11-13]。对于TML和TEL的研究主要集中于外暴露样品，如环境水样、土壤、海产品、动物组织等[13-17]，关于人体生物检材中TML和TEL的研究主要针对血液、尿液中其中1种有机铅或无机铅[18-21]，而同时对血液和尿液中TML、TEL进行形态分析的研究报道较少。血液和尿液是毒物分析领域的常用检材，因此建立人体血液、尿液中TML和TEL的分析方法对于铅中毒的法医学评价十分必要。

本文建立了血液和尿液中TML、TEL的HPLC-ICP-MS分析技术，所建方法准确、可靠、简便，适用于法医毒物分析领域中铅形态的分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

赛默飞ICAP RQ ICP-MS仪(赛默飞世尔科技公司)，Agilent 1200 HPLC仪(配有自动进样器,安捷伦科技有限公司),Element A10 超纯水处理系统(美国Millipore公司)，15 mL 聚丙烯试管(美国Corning公司)。36%～38%盐酸(色谱级)，硫代硫酸钠、乙酸铵、乙酸(优级纯)，甲醇、苯(HPLC级)，TML、TEL标准溶液(1 000 μg/mL)，上述试剂均购于上海安谱公司。

1.2 溶液的配制

储备液：用甲醇分别配制质量浓度为1 000 ng/mL的TML、TEL储备液，置于4 ℃冰箱保存，备用。

标准溶液：用甲醇将TML、TEL储备液逐级稀释配制成3、5、10、20、50、100、150、200、250、300、400、500 ng/mL的混合标准溶液。

1.3 前处理方法

血液：取200 μL血液置于聚丙烯试管中，加入300 μL去离子水和500 μL浓盐酸，再加入4 mL苯溶液超声萃取15 min，离心5 min(5 000 r/min)，取上清液约3.5 mL转移至聚丙烯试管中，提取完上清液的血液中再加入4 mL苯溶液超声萃取15 min，离心5 min(5 000 r/min)，取上清液约3.5 mL，合并两次上清液后，加入5 mL硫代硫酸钠，超声30 min后，取下层溶液约2 mL至进样小瓶中。

尿液：取900 μL尿液置于聚丙烯试管中，加入100 μL去离子水，随后重复血液样品的萃取和反萃取操作步骤。

1.4 色谱与质谱条件

HPLC条件：Agilent Zorbax Plus C18(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)分析柱；流动相：A相为0.1 mol/L乙酸铵-0.1 mol/L乙酸，B相为甲醇；流速：0.4 mL/min；柱温：室温；进样体积：20 μL；流动相洗脱条件：A相为55%，B相为45%。

ICP-MS 条件：RF入射功率为1 550 W，载气为高纯氩气，载气流速为0.64 L/min，辅助气流速为0.8 L/min，采样锥深度为5 mm，泵速为0.4 r/s，积分时间为0.2 s，测量时间为180 s。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

图1 最佳色谱分离条件下TML和TEL的谱图Fig.1 Chromatogram of TML and TEL under optimum separation conditions

2.1.1 色谱条件的选择在流动相比例为35%A相和65%B相的条件下，考察了C18(2.1 mm×50 mm,3.5 μm)和C18(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)2种Agilent Zorbax Plus C18色谱柱对TML和TEL的分离效果。结果表明，使用前者作为分析柱时，TML和TEL不能分离，峰形很差；使用后者作为分析柱时，TML和TEL能分离，但分离度较差。因此选用C18(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)分析柱，并对流动相比例进行了优化。结果显示，当流动相比例为55%A相和45%B相时，TML和TEL可良好分离，且峰形较好(见图1)，TML和TEL的保留时间依次为265.8、332.4 s。优化的色谱条件如“1.4”所示。

2.1.2 前处理条件的优化取200 μL加入“1.2”中系列质量浓度混合标准溶液的血液、尿液样品，分别加入1 mL正己烷、乙醚溶液，涡旋2 min后离心取上层溶液，利用氮吹进行挥干后加甲醇复溶，测定结果显示，TML和TEL的提取回收率低于50%。而采用苯溶液超声萃取2次，硫代硫酸钠溶液进行反萃取的前处理方法，测定结果显示，血液、尿液样品中TML和TEL的提取回收率大于80%，因此实验选择此方法进行样品前处理。

2.2 方法学验证

2.2.1 选择性分别对10个不同来源的空白血液、尿液样品按已建立的方法进行分析，考察内源性物质是否对铅形态化合物有干扰。结果显示，10份不同来源的血液、尿液样品经处理后，待测化合物对应的保留时间处均无内源性干扰峰出现，说明内源性物质不干扰铅形态化合物的测定。

2.2.2 线性关系、检出限与定量下限将“1.2”系列质量浓度的混合标准溶液添加至空白血液、尿液中，按“1.3”方法对样品进行前处理后，采用HPLC-ICP-MS进行检测。以TML和TEL的响应值(y，cps)与其质量浓度(x，ng/mL)进行线性拟合,以TML和TEL的峰强度信噪比(S/N)≥3倍时的质量浓度为检出限(LOD)，S/N≥10且满足精密度和准确度要求的样品最低质量浓度为定量下限(LOQ)。结果表明，血液和尿液中2种铅形态化合物分别在3～200 ng/mL和5～400 ng/mL质量浓度范围内线性良好，相关系数(r2)不小于0.994；LOD为0.85～1.31 ng/mL，LOQ为3.00～5.00 ng/mL(见表1)。

表1 血液、尿液中2种铅形态化合物的线性关系、检出限与定量下限Table 1 Linear relationships,LODs and LOQs of two lead compounds in blood and urine

2.2.3 准确度与精密度按“1.3”方法配制样品溶液，选择低、中、高3个浓度水平在空白血液、尿液中加入混合标准溶液，每个浓度水平平行6份，按照本方法进样检测。根据当日的标准曲线，同法连续测定4 d，计算准确度、日内精密度(n=6)和日间精密度(n=24)，以加标回收率表示准确度，相对标准偏差(RSD)表示精密度。

结果显示，本方法在血液和尿液的加标回收率分别为85.3%～91.8%、85.8%～89.5%，日内RSD为1.8%～9.9%，日间RSD为1.9%～10%(见表2)，符合方法验证学的要求。

表2 血液、尿液中2种铅形态化合物的加标回收率和相对标准偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of two lead compounds in blood and urine

2.2.4 提取回收率及基质效应选取空白血液和尿液为基质，采用低、高两个浓度水平(血液中为3、150 ng/mL，尿液中为5、300 ng/mL)，按“1.3”方法对样品进行处理，分别以空白血液和尿液提取后、前添加混合标准溶液进样测得的峰面积为A、B，对应质量浓度混合标准溶液进样测得的峰面积为C，按照下式计算：基质效应=A/C×100%，提取回收率=B/C×100%。结果显示，基质效应为88.3%～117%，提取回收率为85.3%～104%，说明本方法无明显基质影响。

2.2.5 稳定性分别考察了低、中、高3个质量浓度的空白加标样品(血液中为3、50、150 ng/mL，尿液中为5、150、300 ng/mL)的3次反复冻融稳定性(-20 ℃～25 ℃)及室温稳定性(25 ℃放置24 h)，按“1.3”方法对样品进行处理，采用本方法进行检测。反复冻融稳定性考察结果显示，血液、尿液样品的RSD分别为3.1%～7.4%、1.9%～5.9%；室温稳定性考察结果显示，血液、尿液样品的RSD分别为1.6%～8.5%、2.4%～6.3%。该结果符合要求，表明方法稳定性良好。