P16和P15在恶性黑色素瘤中的表达及其临床意义

陈铨栩 陈湾湾 张 普 罗晓智 赵志光

恶性黑色瘤(malignant melanoma，MM)是起源于表皮黑素细胞的高度恶性肿瘤，其转移性强、发展迅速、预后差及病死率高[1]。近年来世界范围内的黑色素瘤的发生率呈逐年增加的趋势，发病年龄也逐渐年轻化，相应的病死率也随之增加[2,3]。MM发病机制目前尚不明确，大多数MM存在BRAF基因突变，BRAF基因突变与MM发生、发展和预后密切相关[4]。另有研究显示，大部分的痣长到3～5mm会进入生长停滞，只有一小部分色素痣有重新获得增殖并形成黑色素瘤的能力[5]。而原癌基因诱导的停滞与由CDKN2A和CDKN2B基因编码的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P16和P15的表达相关。

本研究应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(streptavidin-perosidase, SP法)免疫组化检测66例MM组织中P16、P15的表达情况，并进行相关因素分析和预后分析，探讨P16、P15在MM中的临床意义。

材料与方法

1.标本来源：收集温州医科大学附属第二医院2013年1月～2018 年1月经病理科确诊为恶性黑色素瘤的患者。纳入及排除标准为：(1)患者病理诊断明确，相关MM免疫组化指标支持，排除可疑性病理诊断及混合其他恶性成分的病理诊断。(2)患者肿瘤均行手术根治，术前未行抗肿瘤治疗。(3)患者临床资料完整，预后分析时排除随访时间不足1年失访的患者。共纳入66例MM的组织标本作为实验组，另设60例同一时期诊断为皮内痣的组织标本作为对照组。

2.研究方法：将所有标本选取病变区域制成组织芯片。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)进行免疫组化。大致过程为：切片经二甲苯、梯度酒精脱蜡水化，3%H2O2酶(北京中杉金桥公司)室温孵育1h，柠檬酸修复液微波加热修复10min并冷却至室温，非免疫血清(北京中杉金桥公司)室温封闭3h，鼠抗人P16、P15抗体(英国Abcam公司)按1∶200稀释后4℃冰箱孵育过夜，二抗(北京中杉金桥公司)室温孵育1h，辣根酶标记链霉卵白素工作液(北京中杉金桥公司)室温孵育1h，DAB试剂(北京中杉金桥公司)显色，苏木精中核复染，梯度乙醇及二甲苯中脱水，中性树胶封片。统计患者的临床及病理资料，包括性别、肿瘤部位、确诊年龄、肿瘤直径、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、Ki-67增殖指数和BRAF V600E基因突变情况等。主要通过电话以及住院观察随访，截止时间至2019年6月，生存期以月为单位。

3.免疫组化结果判定：P16、P15阳性表现为黄色颗粒，主要定位于细胞核，部分细胞质也有少量表达。由两位病理科医生进行双盲阅片，随机观察5个高倍视野(×400)进行结果判定：(1)阳性细胞占总细胞数的比率评分：0～10%为0分，10%(不含)～25%为1分，25%(不含)～50%为2分，>50%为3分。(2)着色深度评分：不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，褐黄色为3分。依据阳性细胞占总细胞数的比率×着色深度得出总分进行判定：<3分为阴性(-)，≥3分为阳性(+)。

4.统计学方法：采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计分析。计数资料采用卡方检验；预后分析采用Kaplan-Meier曲线，生存率比较采用Log-rank检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.P16、P15在恶性黑色瘤与皮内痣组织中的表达情况：P16在恶性黑色瘤和皮内痣组织的阳性表达率分别为30.3%和81.7%；P15在MM和皮内痣组织的阳性表达率分别为22.7%和86.7%。MM中的P16(χ2=33.470,P=0.000)和P15(χ2=51.603,P=0.000)阳性表达率均明显低于皮内痣，详见图1、表1。

图1 P16、P15在MM与皮内痣组织中的表达(SP法，×200)A、B.MM组织中P15、P16的表达；C、D.皮内痣组织中P15、P16的表达。箭头所指为细胞核及细胞质染色。根据免疫组化结果判定：A(-)、B(-)、C(+)、D(-)

表1 P16、P15在MM与皮内痣组织中的表达(n)

2.P16、P15在MM中的表达与临床特征的关系：MM组织中P16的阳性表达水平与肿瘤浸润深度(χ2=17.888,P=0.000)、淋巴结转移(χ2=5.561,P=0.018)和Ki-67增殖指数(χ2=7.108,P=0.008)呈负相关，而与性别、肿瘤部位、确诊年龄、肿瘤直径、远处转移和BRAF V600E基因突变无关(P均>0.05)。P15的阳性表达水平与肿瘤浸润深度(χ2=9.156,P=0.000)、淋巴结转移(χ2=8.817,P=0.003)、远处转移(χ2=4.970,P=0.026)和Ki-67增殖指数(χ2=15.422,P=0.000)呈负相关，而与性别、肿瘤部位、确诊年龄、肿瘤直径和BRAF V600E基因突变无关(P均>0.05)，详见表2。

3.MM中P16与P15表达水平的相关性：MM中P16与P15表达水平呈高度正相关(r=0.744)，详见表3。

表2 P16、P15在MM中的表达与临床特征的关系(n)

*BRAF基因检测时有4例组织因标本量太少无法检测

表3 MM中P16与P15表达水平的相关性(n)

4.P16、P15在MM中的表达与预后的关系：66例MM患者中，有3例患者在后期随访过程中失访，最后共纳入63例患者进行预后分析；其中58例死亡，5例随访截止时仍存活。患者总体中位生存期为22.3个月，95% CI为13.523～31.077，1年、2年和3年生存率分别为82.5%、42.9%和21.9%。P16表达阴性的患者，中位总体生存期明显短于表达阳性的患者(14.0个月 vs 28.6个月)，差异有统计学意义(χ2=5.033,P=0.025)。P15表达阴性的患者，中位总体生存期明显短于表达阳性的患者(14.0个月 vs 33.4个月)，差异有统计学意义(χ2=8.949,P=0.003)，详见图2。

讨 论

恶性黑色素瘤是恶性程度最高的皮肤肿瘤之一，大多数具有很强的侵袭性，较早发生转移，预后极差。虽然我国发生率相对较低，但近年来发生率呈快速增长趋势，已成为严重威胁生命健康的恶性疾病之一[6]。

图2 P16、P15在MM中的表达与预后的关系A.MM患者总体生存期曲线；B.不同P16表达水平的MM患者总体生存期曲线；C.不同P15表达水平的MM患者总体生存期曲线

P16基因位于染色体9p21上，是发现的第一个直接参与细胞周期调控的肿瘤抑制基因，与肿瘤的发生、发展过程密切相关[7]。其表达产物P16INK4A可与CNK4和CNK6特异性结合，阻碍其与细胞蛋白D1形成复合物，使RB磷酸化受阻，使细胞停留在G1期，无法进入S期，抑制肿瘤的增殖[8,9]。P15是CKI中INK4家族成员之一，它通过抑制CyclinD-CDK,将细胞阻断在G1期[10]。当P16、P15基因突变或失活时，P16、P15表达下调，细胞周期无法调控，以致细胞无限生长从而发生肿瘤。临床上，大多数痣长到3～5mm通常会退出增生期进入生长停滞状态。虽然大多数痣仍处于生长停滞状态(甚至在高龄时段消退)，但有一小部分痣存在重新获得增殖并形成黑色素瘤的能力[11]。癌基因诱导的停滞是由细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDKN2A编码的P16和CDKN2B编码的P15高表达促进的[12]。本研究结果显示，P16和P15在MM中表达均下调，可能对鉴别MM和良性黑素细胞病变具有诊断价值。虽然MM中P16和P15的表达呈高度正相关，但相比较而言，P15的表达下调更显著，可能成为诊断MM更可靠的生物学标志物之一，这也与Ma等[13]的研究结果一致。

MM的分期与肿瘤的直径、浸润深度、淋巴结转移和远处转移相关。P16、P15的表达水平与肿瘤的直径并无明显相关性，可能的原因是本研究应用的组织芯片只包括部分肿瘤组织，对于较大的肿瘤有一定局限性。随着病变浸润深度的增加和淋巴结转移，P16、P15的表达逐渐下降，表明两者可能与MM的侵袭与淋巴结转移能力相关，可能的机制是P16、P15基因突变或失活时，细胞周期失去抑制，导致细胞无限生长以致肿瘤侵袭性和转移性增强。Su等[14]研究也显示，在结膜恶性黑色素瘤中P16的表达水平与肿瘤的侵袭能力呈负相关。同时，P15的表达与MM发生远处转移呈负相关，表明在预测MM发生远处转移方面，P15更有优势。另外，表面有无破损也是肿瘤分期的指标之一，然而大部分患者数据缺失，因此并无纳入本研究。Ki-67 是一种细胞增殖相关的核抗原，可以反映肿瘤的增殖、浸润、转移和预后等。本研究以10%为临界点，得出P16、P15的表达与Ki-67增殖指数呈负相关；P16、P15表达缺失，肿瘤细胞增殖更活跃，可能通过多种机制增强肿瘤的侵袭能力。BRAF基因突变是MM最常见的突变方式，主要是BRAF V600E突变，平均突变率为60%～80%，与MM发生、发展和预后密切相关。Mackiewicz-Wysocka等[7]研究显示，色素痣P16的表达水平在BRAF突变型中更高，恶性黑色素瘤P16的表达水平在BRAF突变型中更低。而本研究显示，P16的表达水平与BRAF基因无明显相关性，可能的原因是痣细胞增殖被BRAFV600E瞬时激活，BRAFV600E也诱导P16表达来停止黑素细胞增殖[15]。

国内外关于P16、P15与预后的关系，争议很大。本研究显示，P16与P15的表达水平均与MM的总体生存期呈正相关。P16与P15的表达水平下调，肿瘤细胞增殖更活跃，侵袭能力与转移能力更强，因而患者的预后不佳。吴晓雯等[16]研究也显示，P16 INK4A 基因突变会阻碍与CNK4和CNK6特异性结合，从而肿瘤增殖更活跃，生存期更短。但是，Chen等[17]研究显示，P16高表达预示黏膜黑色素瘤有较差的生存期；Sanki等[18]研究显示，P16的表达与皮肤黑色素瘤的生存期无关。这种争议，可能与纳入的患者的分期以及治疗不同有关，有待于增加样本量进一步研究。

本研究收集了笔者医院近5年的MM患者66例，样本量仍偏少；随访过程中，有3例(4.5%)患者失访；随访截止时，有5例(7.9%)患者仍存活，这对研究结果产生一定的误差。因此，笔者还会进一步纳入相关患者，延长随访时间，以得到更为可靠的结果[19]。

综上所述，P16、P15可能在恶性黑色素瘤的发生和发展中起负性作用，可以作为鉴别MM和良性黑素细胞病变的指标，也可能对MM患者的预后具有一定的指导意义。