甘草酸抑制PI3K/AKT/NF-κB减轻胶原诱导型类风湿关节炎大鼠炎症反应

胡志平 何绍前 王传明 邓莹 魏学军

(黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558025)

类风湿关节炎发病原因不明，属全身性自身免疫病，可由感染、免疫、内分泌失调、环境因素等引发，慢性炎症侵袭小关节致关节受累，滑膜增生，严重者关节畸形，生活质量明显被影响〔1〕。西南地区地处云贵高原，气候潮湿，类风湿关节炎发病频繁。治疗此病的药物多集中于非甾体类抗炎药、免疫抑制剂、激素等，副作用也比较突出，所以寻找有效的抗炎治疗药物较为棘手〔2～4〕。甘草作为中药中补益类品种，有补虚解百毒之功效，含甘草酸、甘草次酸等活性成分，文献称甘草酸有类激素样作用，是否对类风湿疾病有治疗作用未曾确认。因此，本文采用胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠模型作为类风湿疾病模型，初步探讨甘草酸对类风湿关节炎药效及干预机制。

1 材料与方法

1.1试验药物 甘草酸标准品(纯度≥98%)购自北京索莱宝科技有限公司，用1%羧甲基纤维素钠调整到所需浓度。美洛昔康片(批号：284792)上海勃林格殷格翰药业有限公司提供。

1.2动物 SPF级雄性SD大鼠，180～220 g，长沙天勤生物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(湘)-2014-0011。

1.3试剂 β-actin、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸化(p)-蛋白激酶B(AKT)、核转录因子(NF)-κBp65、p-NF-κBp65蛋白，货号#8457、#4257、#4060、#8242、#3033购自CST公司。IκB-α、IKK-α蛋白，货号ab32518、ab32041，购自Abcam公司。牛Ⅱ型胶原，批号31055，购自Chondrex公司。完全弗氏佐剂，批号F6005，购自Sigma公司。山羊抗兔HRG抗体，批号109525，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，货号G1120，购自北京索莱宝生物科技有限公司。白细胞介素(IL)-1β、C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号tw039569、TWp002822、TWp002859)购自上海通蔚实业有限公司。

1.4仪器 石蜡切片机，购自浙江科迪仪器设备有限公司。光学显微镜，购自日本Olympus公司。足趾容积测量仪，购自上海欣软信息科技有限公司。

1.5方法 SD大鼠若干只随机分为空白组和模型组〔5〕，模型组于第1天和第10天尾根部皮内注射牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂体积比1∶1混悬液0.2 ml。致炎后观察足跖关节肿胀度程度，选取双后肢足跖完全肿胀的大鼠，随机分为模型组、美洛昔康组(2 mg/kg)、甘草酸低(60 mg/kg)、中(80 mg/kg)、高(100 mg/kg)剂量组，每组10只。空白组灌胃给予等体积蒸馏水，其余各组用羧甲基纤维素钠调配成相应剂量药物的混悬液灌胃，连续给药42 d。末次给药后检测每组足跖部容积，取脾脏分别放入4%多聚甲醛和取同侧滑膜-80℃低温保存备用。

1.5.1足跖部肿胀度测定 容积测量仪测量各组双后肢足跖部炎症诱导前和炎症诱导后每周肿胀度(肿胀度=炎症诱导后容积-炎症诱导前容积)，记录并统计分析。

1.5.2免疫组化SP法检测脾脏IKK-α、IκB-α、NF-κBp65蛋白表达 70%、80%、90%、100%乙醇分别脱水2 h；二甲苯透明20 min；液体石蜡中浸蜡2次，每次1.5 h；包埋、切片；制作好的切片常规二甲苯脱蜡2次15 min；100%、90%、80%、70%乙醇水化；蒸馏水浸泡1 min；磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡1 min后3%过氧化氢封闭10 min，阻断内源性过氧化物酶；PBS冲洗后滴加Ⅰ抗，浓度比例为1∶100；4℃孵育后滴加Ⅱ抗，浓度比例为1∶200；二氨基联苯胺(DAB)显影后，自来水冲洗，复染，脱水，透明并封片，分析结果。

1.5.3Western印迹检测关节滑膜PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65蛋白表达 根据聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量试剂盒要求蛋白定量后，十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)制备试剂盒制备12%的分离胶和5%的浓缩胶，5%浓缩胶上样后电泳40 min，12%分离胶电泳1.5 h，转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭2 h后加Ⅰ抗，内参Ⅰ抗1∶ 8 000、其他Ⅰ抗1∶1 000，加入Ⅱ抗1∶10 000，TBST冲洗3次，显影液显影，拍照后分析结果。

1.5.4ELISA试剂盒检测IL-1β、CRP、TNF-α 腹主动脉取大鼠血浆，3 000 r/min离心15 min，取上清液，根据试剂盒要求，制定好标准曲线后，按试剂盒操作步骤进行。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件进行t及秩和检验。

2 结 果

2.1各组足跖部肿胀度比较 与空白组比较，模型组大鼠足跖肿胀容积明显增大(P<0.01)。与模型组比较，炎症诱导第5、6周甘草酸高、中、低剂量组、美洛昔康组具有明显抑制炎症肿胀的作用，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见表1。

2.2甘草酸对CIA脾脏IKK-α、IκB-α、NF-κBp65蛋白表达影响 与模型组比较，空白组、甘草酸高、中、低组、美洛昔康组IKK-α、IκB-α、NF-κBp65蛋白平均光密度值表达显著下降,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见表2，图1～3。

表1 炎症诱导后不同时间各组足跖部肿胀度比较

续表1 不各组足跖部肿胀度比较

与模型组比较:1)P<0.05,2)P<0.01，下表同

表2 甘草酸对CIA脾脏IKK-α、IκB-α、NF-κBp65蛋白平均光密度值影响

图1 甘草酸对CIA大鼠脾脏IKK-α蛋白表达的影响(DAB，×400)

图2 甘草酸对CIA大鼠脾脏IκB-α蛋白表达的影响(DAB，×400)

图3 甘草酸对CIA大鼠脾脏NF-κBp65蛋白表达的影响(DAB，×400)

2.3各组血浆IL-1β、CRP、TNF-α表达比较 与模型组比较，甘草酸对血浆中IL-1β、CRP、TNF-α炎性因子表达均呈下调趋势，表明甘草酸有一定的抑炎作用。见表3。

2.4甘草酸对CIA关节滑膜PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65蛋白表达影响 与模型组相比，甘草酸各剂量组、美洛昔康组PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65蛋白表达量被受到不同程度抑制，表明甘草酸能够抑制关节滑膜内PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65蛋白过表达。见表3，图4。

表3 甘草酸对血浆IL-1β、CRP、TNF-α及CIA关节滑膜PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65蛋白表达的影响

1～6:空白组，模型组，美洛昔康组，甘草酸低剂量组，甘草酸中剂量组，甘草酸高剂量组图4 甘草酸对CIA关节滑膜中PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65蛋白表达的影响

3 讨 论

类风湿关节炎作为慢性自身免疫性疾病，反复滑膜炎侵蚀关节软骨与骨组织，造成持续性骨质破坏，最终导致骨关节畸形，致残率较高，临床治疗也比较棘手。目前，临床针对此病的治疗一般多以缓解炎症为主，严重者佐以激素治疗。抗炎药可诱发胃肠溃疡及骨髓再生抑制等副作用，激素则容易引发库欣综合征等副作用。有多靶点抗风湿作用的中药、中成药、中药复方、中药单体成分在治疗类风湿关节炎方面取得较好的疗效，用药安全性有明显优势优于常规化学药物，因此日益受到重视〔5，6〕。本实验结果表明，甘草酸干预后能明显减轻足跖关节炎性肿胀的情况。类风湿性关节炎诱导的过程中，作为自身免疫性疾病，体液免疫和细胞免疫交互作用，病灶区异常激活大量炎症因子，CRP是机体非特异性免疫机制的一部分，它在Ca2+存在时可结合细胞膜上磷酸胆碱激活补体，增强白细胞的吞噬作用，调节淋巴细胞或单核/巨噬系统功能，促进巨噬细胞组织因子的生成。单核-巨噬细胞大量分泌IL-1α和β，进而激活T细胞活化，B细胞激活。TNF-α和β，前者来自单核-巨噬细胞，后者由活化T细胞产生，造成IL-1β、TNF-α等参与类风湿关节炎病理发病过程〔7〕。服用甘草酸后可显著抑制类风湿关节炎体内IL-1β、CRP、TNF-α的过表达〔8,9〕。PI3K/Akt/NF-κB信号通路在正常生理反应和炎症进程中发挥着不同作用,包括促进细胞的增殖、生存和分化等。PI3K/Akt通路激活后,活化的Akt通过增强NF-κB抑制蛋白IκB激酶的磷酸化、降解,继而导致NF-κB的活化。PI3K/AKT/NF-κB信号通路作为T细胞、B细胞炎性信号通路中的交会点，其标志蛋白IKK-α、IκB-α、NF-κBp65、PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65在类风湿关节炎大鼠模型中表达增强。这些标志蛋白经甘草酸干预后表达被明显抑制。本实验表明甘草酸口服有效控制CIA大鼠关节炎症，可能与该药抑制血液中IL-1β、CRP、TNF-α因子的释放继而抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路途径中关键蛋白IKK-α、IκB-α、NF-κBp65、PI3K、p-AKT、p-NF-κBp65蛋白的过表达有关。