胎盘间充质干细胞外泌体对大鼠卵巢早衰修复作用的研究

马丽丽，杨玲玲，杨海燕，黎跳宁

（1.宁夏医科大学总医院，宁夏 银川；2. 宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室，宁夏 银川）

0 引言

随着肿瘤患者的治愈率和存活率的逐渐提高，放化疗引起的卵巢早衰（POF）严重影响育龄女性肿瘤患者的生殖及心理健康。目前尚无有效的治愈办法。近年来，外源性间充质干细胞( MSC) 疗法为包括POF 在内的各种难治性疾病带来了希望。国内外研究证实MSCs 携带的外泌体（exosomes）能够进入体内减轻组织损伤程度，促进受损组织的修复，是干细胞领域具有重要研究价值的新兴热点。本研究通过对POF 模型大鼠腹腔注射人胎盘间充质干细胞（human placenta derived mesenchymal stem cells，hpMSCs）外泌体，检测POF 大鼠卵巢功能，分析 hpMSCs 外泌体对大鼠卵巢功能的修复作用，为临床治疗POF 提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验选择具有正常动情周期的SPF 级 SD 雌性大鼠60 只，10 周龄，体重200-220g。胎牛血清（Hyclone公司），exoEasyMaxiKit（德国 QIA-GEN 公司），ELISA试 剂盒购自R&D 公司，苏木精染色试剂盒（北京博奥森生物有限公司），其他试剂购自sigma 公司。

1.2 实验方法

按照实验室常规程序，SD 大鼠每日腹腔注射环磷酰胺，腔注射环磷酰胺首剂量为50mg/kg，维持剂量为8mg/kg，连续注射 14ds，建立 POF 模型组。

实验分为对照组，模型组和hpMSCs-EXO 治疗组。模型建造成功后，hPMSC-EXO 治疗组腹腔内隔日注射 150ug 外泌体蛋白（约 1×106hPMSC 产生），2周处死检测各种指标。

1.3 外泌体的提取与鉴定

培养P3 代hpMSCs 细胞融合至70-80% 时，更换无血清培养基，培养48h，收集细胞培养上清。取 10mL培养上清，采用 ExoQuickTM 按5:1 比例提取 Exosome；BCA 蛋白定量试剂盒检测 Exosome 蛋白含量；透射电镜下观察Exosome 的形态。

1.4 卵巢功能的测定

1.4.1 ELISA 法测定血清激素

取各组大鼠眶静脉血，严格按照ELISA 试剂盒测定各组大鼠血清 FSH 和E2 的浓度。按照仪器灵敏度和批间、批内变异系数测定各组样本，经仪器得出读数，于标准曲线中读出相应的浓度。

1.4.2 HE 染色法

颈椎脱位法处死大鼠，取卵巢，收集的卵巢经4% 多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片常规苏木素- 伊红（HE）染色，观察卵巢组织及卵泡的形态，同时在光学显微镜下计数各个时期的卵泡数量，进行比较。

1.4.3 统计学方法

2 结果

2.1 HpMSCs 外泌体透射电镜下形态及蛋白表达

透射电镜下观察 Exosome 呈圆形或椭圆形的膜性小囊泡，大小不一，包膜完整，直径30～100nm，囊泡内有低密度电子存在，其周围有类脂膜性结构（图1）。经Western Blotting 分析后，hpMSCs 外泌体表达表面抗原标记物CD9、CD63 等，不表达Lamp1（溶酶体标志物）和Calnexin（内质网标志物），说明本研究提取的外泌体，无溶酶体与内质网成分（图2）。

图1 透射电镜下 Exosome 形态(×25000)

图2 胎盘间充质干细胞及exsomes 相关标记物的 Western Blotting 条带图注：a 胎盘间充质干细胞；b 提取出的exsomes

2.2 HpMSCs 移植前后大鼠血清FSH、 E2 测定

HpMCs-EXO 治 疗 组 FSH 明 显 低 于 模 型组（P＜0.05），E2 值明显高于模型组（P＜0.05），二者与对照组相比均无显著性差异（P＞0.05）。表明治疗组FSH、 E2 值均接近对照组水平。见表1。

表1 各组大鼠血清FSH、E2 水平

2.3 hpMSCs 移植前后各组卵巢卵泡计数

由表2 可以看出，相比POF 模型组，hpMCs-EXO治疗组卵巢内各级卵泡数目均有明显增加，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠卵巢卵泡计数比较

2.4 卵巢结构 HE 染色

HE 染色结果显示，hpMSCs-EXO 治疗组可见各级卵泡，成熟卵泡存在，见间质纤维化，坏死；未移植组结构混乱，有闭锁卵泡存在，组织开始纤维化，坏死（见图 3）。

图3 卵巢HE 染色（×400）（a POF 组 b hpMSCs 治疗组）

3 讨论

干细胞移植治疗越来越多的被应用于改善及治疗某些疾病。hPMSCs 目前证实是干细胞的最佳来源。相较于其他干细胞，hPMSCs 具有来源方便，细胞数量充足，易于分离、培养、扩增和纯化，传代扩增30 多代后仍具有干细胞特性。研究证明[1-2]：hPMSC 分泌的细胞因子如血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 和胰岛素样生长因子(IGF) 等可抑制已受损靶细胞的凋亡，修复已受损的组织细胞。NaYi[3]等研究报道hPMSC 可以使Akt 磷酸化，激活PI3K/Akt 信号通路，减少POF小鼠卵巢中颗粒细胞凋亡，从而改善卵巢功能。另有实验结果显示[4-5]，hPMSC 在体内外能抑制化疗药物诱导的卵巢颗粒细胞凋亡，通过分泌抗氧化物质修复化疗所致卵巢损伤，部分改善卵巢发育微环境及内分泌功能，之后发现给环磷酰胺所致POF 的大鼠移植hPMSCs 后，可通过SIRT1/PGC1-a/Nrf2 信号通路激活，改善卵巢内分泌的功能，减少卵巢纤维化，提高卵巢抗氧化功能[6]。但与正常的卵巢功能还存在一定差距。

近年来有关细胞分泌的外泌体(exosomes)的功能和作用机制的研究已成为热点。exosomes 是一类直径在30-100nm，含有RNA 和蛋白质的囊泡，具有脂质双层膜结构，存在于机体几乎所有的体液中。SUN L 等[7]研究发现人脐带间充质干细胞(UCMSC)分泌的外泌体可以融入顺铂损伤的卵巢颗粒细胞，通过上调抗凋亡蛋白 Bcl-2 表达，下调促凋亡蛋白 Bax 表达，加速卵巢功能的恢复。Xiao 等[8]报道在化疗药物导致的POF大鼠模型中，来源于羊水间充质干细胞的外泌体，富含miR-146a 和 miR-10a 两种 microRNA（miRNAs），其中miR-146a 通过下调Irak1 和traf632 表达，miR-10a通过抑制Bim 表达，下调Caspase-9 表达，从而抑制颗粒细胞凋亡和减少卵泡闭锁，恢复损伤卵巢的功能。也有学者发现[9]人羊膜上皮细胞(hAEC) 外泌体通过转移功能性miRNA（如miR-1246）抑制化疗诱导的颗粒细胞凋亡,恢复POF 小鼠卵巢功能。

目前尚无hpMSCs 外泌体对POF 大鼠卵巢功能修复的研究报道。本实验用hpMSCs 外泌体移植修复化疗损伤大鼠卵巢，结果显示卵巢内各级卵泡数目均有明显增加，证实了hpMSCs 外泌体能够通过旁分泌的方式发挥对化疗所致卵巢损伤的保护作用。但外泌体究竟通过何种机制发挥其改善卵巢功能的生物学效应，需要后续进一步的实验研究。