地肤子皂苷Ic 抑制头颈癌细胞HN30 迁移的机制研究

王炜伟，李幸丽，钱峰*

（1.大理大学药学与化学学院，云南 大理；2. 上海交通大学药学院 细胞与治疗抗体工程研究中心，上海 ）

0 引言

头颈癌主要为颈部肿瘤、耳鼻咽喉肿瘤和口腔颌面部肿瘤，是发病率排在第六位、死亡率排在第八位的最常见癌症[1]。临床上，90% 的头颈癌患者为头颈鳞状细胞癌。迄今为止发现烟草使用和酒精是导致头颈癌的危险因素，并且它们具有协同效应[2]。近年来，因为患者仍然经常出现局部复发、远处转移和第二原发性肿瘤，即使结合放射治疗、化疗、外科手术以及免疫等手段，对于头颈癌患者来说生存率并没有明显提高，其导致预后性差的很重要的原因之一就是肿瘤易形成转移瘤。因此寻找开发新型天然抗肿瘤药，诱导头颈癌细胞死亡，抑制其迁移，对于头颈癌的治疗具有重要意义。

地肤子皂苷Ic 来源于藜科一年生草本植物地肤子Kochia scoparia (L.) Schrad 的果实。地肤子皂苷Ic 属于齐墩果酸3-O-β-D-吡喃木糖(1 →3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷，是一种天然三萜皂苷[3]。目前研究应用主要集中在其降糖，抗瘙痒、抗过敏，保护胃粘膜等功效方面，但是对于地肤子皂苷Ic 的抗肿瘤活性国内外鲜有报道，因此，本研究主要是探讨地肤子皂苷Ic 对于头颈癌细胞HN30 迁移的影响，并进一步研究地肤子皂苷Ic 发挥抑制肿瘤迁移作用的分子机制，证明地肤子皂苷Ic 能够有效抑制ERK 信号通路以及有效激活JNK 和p38MAPK 信号通路，同时上调p53 的表达，从而抑制头颈癌细胞HN30 的迁移。

1 试剂与仪器

1.1 主要试剂

地 肤 子 皂 苷 Ic（C14H64O13;MW：764.93；纯度＞98%）购自上海陶素生化技术有限科技公司。DMEM 培养基和100×青霉素/链霉素购自美国 Life technologies 公司，胎牛血清购自杭州天杭生物科技有限公司。抗体 p-p38MAPK，Total-p38MAPK，p-ERK，Total-ERK，p-JNK，Total-JNK，p53，β-actin 购自美国Cell Signaling Technology 公司。

1.2 主要仪器

Bio-Rad 凝 胶 成 像 仪（ChemiDoc MP）；显 微镜 (NIKONECLIPSETi-S,TS-100, 日 本 )；生 物 安 全柜（CLASS II BSC，ESCO 公司）；Centrifuge 5418R 离心机(Eppendorf,)；二氧化碳培养箱(BB15，Thermo Scientific 公司 )；微量移液枪 (Eppendorf, Gilson)；蛋白凝胶电泳仪(Bio-rad)。

2 实验方法

2.1 细胞培养

人源HN30 癌细胞（购买自ATCC）用含 10% 胎牛血清、1 % 青霉素/ 链霉素的DMEM 培养基进行培养，37℃水浴快速复苏细胞，将复苏的细胞转移到加有DMEM 完全培养基的离心管中，1000rpm/3min 离心，后弃上清，用1mL 培养基将细胞沉淀重悬，移到加有培养基的皿中，并使细胞均匀分布于培养基中，将细胞置于 37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。观察细胞生长状态，及时进行换液及传代，当细胞生长至对数生长期时，即可进行传代、铺孔及冻存。

2.2 划痕试验

实验分组为DMSO 组和给药组，给药组设置药物浓度分别为 0.3μM、1μM 和 3μM，首先将对数生长期的HN30 细胞以5×105个/mL 的浓度接种至12 孔板中，过夜培养。在每个孔中用枪头划个“十”字，弃培养基，用PBS 将不贴壁的细胞洗净，加入无血清培养基，然后按照分组给药后在37℃5%CO2培养箱中培养18h，镜下观察细胞愈合状态，用 Image J 软件对其进行数据分析和统计。

2.3 Western Blot 检测蛋白表达

实验分组为DMSO 组和给药组，给药组设置药物浓度分别为 0.3μM、1μM 和 3μM，首先将对数生长期的HN30 细胞以5×105个/mL 的浓度接种至12 孔板中。按照实验分组药物孵育18 小时后，弃掉培养基，用适量 PBS 洗涤两次，加入 100μLloadingbuffer（175mM/LTris-HCl，100mM/LDTT，7.5% 甘油，4.0%SDS 和 0.2%的溴酚蓝溶于蒸馏水中），细胞充分裂解后用细胞刮收集样品。样品于恒温混匀仪中，99℃下处理10 分钟使蛋白变性。

取10μL 样品上样至SDS-PAGE 胶样品孔中，电泳一定时间后转膜70 分钟，接着用5%的脱脂奶粉室温下封闭2 小时，加入一抗4℃孵育过夜，用1×TNE缓冲液洗膜，每次7 分钟，洗3 次，加入相应的二抗，常温下孵育 2 小时，TNE 缓冲液洗膜，每次 5 分钟，洗 2 次，加入ECL 底物在凝胶成像仪显影，显影后将得到的目的条带用ImageJ 软件进行灰度值分析和统计。

2.4 统计学分析

实验中所得数据均为至少 3 次独立重复试验的结果，并用平均值± 标准误（mean±SEM）来表示，用 GraphPad Prim 5 软件进行数据处理和分析，并使用one-way ANOVA，Newman-Keuls 法 检 验，P＜0.05 被认为差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 地肤子皂苷Ic 抑制头颈癌细胞HN30 细胞的迁移且具有剂量依赖性

迁移是肿瘤的一大特征，有效抑制肿瘤的迁移在治疗肿瘤中具有很大意义，如图所示，图A 为化合物地肤子皂苷Ic 的化学结构，图B 是不同浓度的地肤子皂苷Ic 刺激HN30 细胞18 小时后，细胞愈合情况，图C是细胞愈合能力的统计，从图B 可以看出，相同条件处理下，18 小时后，在没有药物作用下，细胞愈合能力很强，在3μM 药物作用下，愈合能力明显减弱，图C 统计图可以看出随着药物浓度的增加，细胞愈合能力逐渐降低，说明其具有药物依赖性。

图1注: 地肤子皂苷 Ic 抑制HN30 头颈癌细胞迁移，图A 为地肤子皂苷Ic 的化学结构式；图B 为通过划痕实验证明地肤子皂苷Ic 抑制HN30 头颈癌细胞的迁移；图C 是通过划痕实验来测量伤口愈合率来反应抑制细胞迁移的能力。其结果用平均值±标准误（mean±SEM）来表示，三次独立重复试验，***P＜0.001 。

3.2 地肤子皂苷Ic 影响MAPK 信号通路的活化以及P53 的表达

MAPK 通路不仅在不同细胞的增殖、分化和基因表达中起关键作用，而且在肿瘤细胞的生长和转移中也起重要作用[8-10]。通过蛋白免疫印迹法检测，发现地肤子皂苷Ic 可以有效抑制ERK 的磷酸化，促进JNK 和p38MAPK 的磷酸化从而有效活化MAPKs 信号通路，从而抑制了头颈癌细胞HN30 的迁移。

p53 基因是与肿瘤相关性较高的基因，当细胞中的DNA 损伤或细胞增殖异常时，p53 基因被激活，导致细胞周期停滞并启动DNA 修复机制，使损伤的DNA 得以修复。然而，当DNA 损伤过度而无法被修复时，作为转录因子的p53 还可进一步激活下游促凋亡基因的转录，诱导细胞凋亡并杀死有DNA 损伤的细胞从而抑制肿瘤细胞的迁移[12-13]。通过蛋白免疫印迹法检测发现，地肤子皂苷Ic 具有激活p53 的作用，并具有剂量依赖性，随着地肤子皂苷Ic 的剂量的增加，p53 的表达量逐渐增高。

4 小结

地肤子皂苷Ic 是一种具有明确结构且在植物中提取的天然化合物，有相关研究报道地肤子皂苷Ic 具有抗过敏、抗高血糖以及镇痛抗炎作用[19-20]，可预防高脂血症、高血压、肥胖、动脉粥样硬化等代谢综合征[18]保护胃黏膜[3]等的生物学活性，也有少数对于其可以抗肿瘤的研究，有相关文献报道地肤子皂苷Ic 可以有效抑制HepG2肝癌、前列腺癌的增殖促进其凋亡[4-7]，但是对地肤子皂苷Ic 是否抑制头颈癌细胞HN30 的迁移尚不清楚。

图2注：为确定地肤子皂苷 Ic 发挥抑制HN30 头颈癌细胞迁移的作用机制，检测一些关键蛋白的表达情况是非常重要的，在多次Western blot 检测过程中，有一些变化明显的蛋白。图A 所示，用不同浓度的地肤子皂苷Ic（0、0.3、1 和3 µM）处理HN30 细胞18 小时后，收取蛋白样品检测蛋白表达，条带显示地肤子皂苷Ic 在1µM 浓度下p-ERK 发生了明显的下降，而且可以预测的是药物的剂量依赖性，药物浓度逐渐增加，变化就更明显了，p-JNK 和p-p38 MAPK 在0.3µM 的浓度下明显上升，且具有剂量依赖性，随着药物剂量的增加，其蛋白含量逐渐增加，p53 在3µM 浓度下蛋白含量明显增加，利用Image J 软件对p-Erk (B)、p-Jnk(C)、p-p38 (D)、p-p53 (E) 的表达进行量化，其结果用平均值±标准误（mean±SEM）来表示，三次独立重复试验，*P＜0.05,**P＜0.01, ***P＜0.001。

细胞增殖、生长、分化和代谢等调节失控导致恶性肿瘤的发生与发展。癌细胞极容易发生迁移与侵袭，形成转移瘤，因此有效地抑制癌细胞的迁移与侵袭尤为重要[3]。有研究表明分别用芍药苷和蒙花苷刺激肿瘤细胞，24 小时后明显抑制肿瘤细胞迁移[21-22]；用雷公藤甲素刺激肿瘤细胞，12 小时后就可以显著抑制肿瘤细胞的迁移[23]；在本研究中，我们以人源头颈癌细胞HN30 作为体外肿瘤模型，通过用不同浓度的药物对其进行刺激18 小时后发现，地肤子皂苷Ic 在1μM 的浓度下就能够有效抑制肿瘤细胞的迁移，并且随着药物浓度的增加其抑制效果愈加明显，因此，要想使药物具有临床使用的可能，开发具有有效剂量小，短时间就可有显著作用，且毒性小等特点的药物是目前药物研究的重点。

MAPKs 信号通路在肿瘤细胞的生长和迁移中起着重要的作用，ERK 信号通路的激活，则会促进上皮间质转化从而促进肿瘤细胞的迁移[13]，例如雷公藤甲素通过抑制ERK 信号通路来抑制食管鳞癌的迁移[23]；JNK 和p38 MAPK 这两种途径调节细胞的生存与分化，激活这两条途径则会有效抑制肿瘤细胞的迁移[14-17]，例如芍药苷通过激活p38MAPK 信号通路，抑制人乳腺癌MCF-7 细胞的迁移[22]，丹参酮II 通过JNK 信号转到通路抑制人骨肉瘤的迁移[24]；在对于肝癌的研究发现，地肤子皂苷Ic 可以通过调节MAPKs 和PI3K/AKT 信号通路促进肝癌细胞的凋亡[7]；对于前列腺癌的研究发现，地肤子皂苷Ic 可以作为一种新型的天然的SENP1 抑制剂有效地抑制前列腺癌的迁移[24]，在对于地肤子皂苷Ic 抑制头颈癌细胞HN30 迁移的作用机制的研究中，我们通过蛋白免疫印迹法检测了MAPKs（包括 ERK、JNK 和 p38 MAPK）通路相关蛋白以及p53 的蛋白表达情况来研究地肤子皂苷Ic 抑制肿瘤迁移的可能的作用机制，结果发现地肤子皂苷Ic 可以有效抑制ERK 的磷酸化水平以及激活JNK 和p38 MAPK 的磷酸化水平，同时亦可以提高p53 的表达水平。P53 作为抑癌基因受多种信号因子的调控，有文献报道p38MAPK 信号通路可以上调p53,且有文献报道p53 信号通路可以激活RECK，RECK 基因是近年来发现的新型MMP 抑制剂，可以在转录后水平抑制多种MMP 的表达，从而抑制肿瘤的迁移[26-27]，因此在地肤子皂苷Ic 抑制头颈癌细胞HN30 的迁移研究中，极有可能是通过激活p38MAPK 信号转导通路，上调p53，从而抑制了头颈癌细胞HN30 的迁移，但此结论有待进一步进行试验论证。

在本研究中我们发现地肤子皂苷Ic 能够有效抑制头颈癌细胞HN30 的迁移，地肤子皂苷Ic 抑制ERK 信号通路，同时激活JNK 和p38 MAPK 信号转导通路，此外，地肤子皂苷Ic 激活抑癌基因p53，从而抑制头颈癌细胞HN30 的迁移。本研究发现地肤子皂苷Ic 具有抗肿瘤活性，为开发此类抗肿瘤药物提供了一定理论依据。