脑脊液细胞蜡块技术在脑膜癌病诊断中的应用

张巧全，余 年，王 娟，朱海青

脑膜癌病(meningeal carcinomatosis, MC)是中枢神经系统转移癌的一种特殊类型，其诊断依赖于反复多次脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)的细胞学检查；目前国内多采用玻璃管离心法收集CSF细胞，经MGG染色或免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC)后镜检而诊断[1]。但患者常由于各种原因导致不能多次获取CSF标本或对脑组织活检，从而对疾病诊断及分子分型造成困难。Nathan等[2]研究发现，恶性胸腔积液患者细胞蜡块制备能部分或全部代替组织标本，对疾病的诊断、恶性肿瘤的组织分型及进一步分子分型作出判断。目前尚未有CSF细胞蜡块技术的文献报道。本实验针对26例临床及CSF病理细胞学明确诊断的MC患者的CSF，应用CSF细胞蜡块制备对MC诊断的回顾性评估及技术探讨。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集南京医科大学附属脑科医院2014年1月～2019年3月期间收治的26例MC患者，其中男性16例，女性10例；年龄范围16～92岁，平均54.5岁。临床表现：头痛、头晕、呕吐者11例，抽搐、意识障碍、认知功能减退为主要表现者7例，以复视或视物成双、听力下降、面神经麻痹为主要表现者6例，以肢体无力疼痛、小便障碍为主要表现者2例。入组标准[1]：(1)既往有肿瘤病史或者本次入院检查发现系统性肿瘤；(2)具有脑部、颅神经、脊髓等受累的一组或多组临床表现和体征；(3)辅助检查至少具备下列特征之一：①腰部穿刺显示颅内压增高，CSF蛋白增高，激活的单核细胞计数增高；②头颅MRI示脑膜增厚或脑膜线状、条索状强化；(4)CSF病理细胞学或ICC染色发现肿瘤细胞，或存在与原发肿瘤一致的肿瘤细胞或cDNA。

1.2 细胞蜡块制备应用正常血浆在CSF制备蜡块方法：由于CSF蛋白含量较少，高速离心后很难形成肉眼可见的沉淀。加入正常人血浆后可适量增加CSF的蛋白含量，且血浆中纤维成分较高，易于制块。乙醇为还原剂[3]，能沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白和纤维蛋白。CSF细胞蜡块制备步骤：CSF和血浆按4 ∶1比例充分混匀，加入80%乙醇0.5 mL，用加液枪(或吸管)轻轻打匀；3 000 r/min，15 min，用一次性吸管，吸除上清液，再用加液枪(或吸管)缓慢加入2.5%戊二醛(或10%中性福尔马林)固定，置入4 ℃冰箱。按常规石蜡包埋制备蜡块，参考本课题组既往方法制备[4]。

1.3 ICC染色在细胞蜡块中的应用ICC染色步骤：石蜡切片机将细胞蜡块连续2.0～3.0 μm厚切片，服贴于防脱载玻片上；60 ℃烤片1 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇至水化。首先抗原修复，3%H2O2处理2 min；PBS液冲洗，采用SP法染色(抗体购自北京中杉金桥公司)：一抗室温孵育2 h，PBS液冲洗，二抗室温孵育30 min，PBS液冲洗，DAB显色。PBS代替一抗作阴性对照，苏木精复染，封固。免疫组化染色细胞均着色好，易于镜下观察。

2 结果

2.1 传统CSF细胞免疫组化染色常规CSF MGG染色(图1A)、ICC染色(图1B、C)、HE染色(图1D)显示肿瘤细胞数目较少，背景染色深而不易观察，此外样本无法长期保存，临床诊断需多次重复穿刺CSF送检，3例患者初次CSF发现肿瘤细胞，7例患者第2次CSF发现肿瘤细胞，9例患者第3次，7例患者第4次发现肿瘤细胞。

2.2 CSF细胞蜡块ICC染色26例MC患者细胞蜡块均制作成功，结合ICC染色的癌细胞检出率：癌细胞EMA、CK(+)，CD14、GFAP(-)。其中15例(57.70%)CKL(+)、CKH(-)，诊断为转移性腺癌；7例(26.92%)CKH(+)、CKL(-)，诊断为转移性鳞癌，4例(15.38%)CKH、CKL均(+)，诊断为腺鳞癌(图2)。

3 讨论

MC既往又称癌性脑膜炎，是指恶性肿瘤弥漫性或多灶性脑膜(包括硬脑膜、蛛网膜及软膜)和脊膜播散或浸润，肿瘤侵犯脑膜后可能通过若干途径进入CSF，包括经脑膜小血管直接转移到CSF，先侵犯硬脑膜后再逐渐生长进入CSF，自脑表面的转移病灶上脱落到CSF，以及沿神经根生长进入CSF等，而颅内并无占位性实质病变，为中枢神经系统转移瘤的一种特殊类型，属于癌症患者晚期阶段严重的中枢神经系统并发症。WHO(2018)全球癌症报告显示MC发病率逐年增高。肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，20%～65%的肺癌患者在病程中会发生脑转移，是脑转移性肿瘤中最常见的类型，预后差，平均生存时间仅1～2个月[5]。

近年尽管国外有多种MC诊断方法，如CSF流式细胞仪法、CSF体外细胞循环法[6]、18F-FDG PET/CT[7]等，但其最终确诊均依赖于CSF细胞学，该方法敏感性为75%～90%，特异性为100%，重复3次送检检出率>90%。但临床上诸多MC患者由于疾病进展迅速，颅内压增高明显，无法多次进行腰部穿刺检查，限制其临床应用。

体液细胞学蜡块技术已在胸腹腔积液[8]、子宫颈液基细胞等中进行探讨和应用，目前尚未在CSF细胞学中进行探索。本实验结果显示，与传统CSF细胞病理学技术相比，CSF 细胞蜡块技术的制备程序较为简单，可重复性好，肿瘤细胞检出率较高，易于ICC染色和识别；此外避免了多次腰部穿刺，便于长期存储，且能够被临床多次应用，有助于MC患者进一步诊断及评估。与腹腔液、子宫颈液等体液相比，CSF蛋白含量较低，需要外源血浆蛋白等辅以沉淀制块。

普通CSF细胞制作过程中吸取的少量且制作完毕后剩余的CSF样本往往被遗弃，而细胞蜡块可以收集送检CSF中的绝大部分细胞，以便观察大部分细胞的形态，且细胞蜡块易于保存。本实验均是利用普通CSF细胞制作后剩余的CSF进行蜡块制作。CSF细胞沉淀物制作成的细胞蜡块，起到聚集细胞的作用，相当于组织块，可长期保存，能够连续切片，其切片较薄，镜下观察细胞HE染色结构清晰，核质分明，颜色鲜艳。如诊断需要可部分行ICC染色，记录诊断结果并分析，便于进一步行其他特殊染色及原位基因检测等。

因此，此项CSF细胞蜡块制备技术操作简单，耗材少，便于普及推广，对特殊病因的诊断有一定的应用价值。细胞蜡块组与常规组诊断一致性好，表明细胞蜡块技术能够代替特殊CSF的检查，CSF细胞蜡块制备较好地为诊断提供新方法和途径，可推荐为CSF细胞学诊断的另一种方法。