代谢型谷氨酸受体7对人胚胎神经干细胞增殖的影响

辛宁宁，张云清，李二乐，拓庆银，贺 晶*

(1.咸阳师范学院校医院，陕西 咸阳 712000；2.延安大学附属医院，陕西 延安 716000；3.延安市人民医院，陕西 延安 716000)

神经干细胞(NSCs)是具有多潜能和自我更新特性的细胞，它们存在于哺乳动物的发育期和成年期的中枢神经系统(CNS)内[1-3]。这些祖细胞能够从胚胎和成年脑中分离，在有丝分裂原例如表皮生长因子(EGF)[4]和基本的成纤维生长因子(bFGF)[5]时体外培养扩增为神经球。这些细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞三种不同神经细胞的潜能。近十年来，神经干细胞已经被研究用来治疗CNS疾病，神经干细胞治疗已经被广泛认为能改善脑缺血、神经损伤和神经变性紊乱疾病后的神经功能[6]。然而，这些过程的分子机制仍然不清楚。因此，研究调控NSCs增殖过程的分子机制具有非常重要的临床价值。

谷氨酸是CNS中的一个主要的兴奋性神经递质，它可能与神经发生相关[7]。脑损伤涉及谷氨酸兴奋性中毒，例如脑缺血和癫痫，但是它们也能刺激神经发生。谷氨酸受体信号可能调控脑损伤后的神经发生。代谢型谷氨酸受体(mGluRs)包括mGluR1-8，属于G蛋白偶联受体家族，可能调控人大脑神经干细胞的增殖[8]。在本研究中，旨在探究mGluR7对体外培养的人胚胎NSCs增殖的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胚胎由延安大学附属医院妇产科提供，实验标本选取均通过患者及家属同意，并签署知情同意书，并均遵循延安大学伦理委员会规定。

mGluR7抗体购置于美国Santa Cruz Biotechnology公司,β-actin抗体购置于美国santa公司,山羊抗血清购置于北京中杉金桥公司。各类限制性内切酶、T4 DNA连接酶、逆转录试剂盒(Prime Script3® RT)和SYBR®均购买自TaKaRa公司,质粒抽提及凝胶回收试剂盒购买自Qiagen公司,10×annealing Buffer、蛋白裂解液(Radio Immunoprecipitation Assay,RIPA)和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自碧云天公司,脂质体转染试剂转染试剂LipofectamineTM2000和TRIzol购自Invitrogen公司,双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司,MTT购自Sigma公司,蛋白发光液和PVDF膜购自Millipore公司,其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 人胚胎脑皮质NSCs的分离和培养 取12～16 w人流产胚胎，取回后立即置于4℃生理盐水，无菌条件下并在冰上操作，分离大脑皮质，DMEM/F12基础培养基洗涤2次，PBS洗涤1次。将游离好的大脑皮质移入含有1～2滴PBS的小烧杯中，用火焰抛光的巴氏滴管吹打100～150次，使皮质脑组织分散为单细胞悬液，用200目筛网滤除组织块，将收获的细胞悬液移入离心管中，800 rpm离心8 min，弃去上清，用基础培养基洗涤细胞2次，再加入3 mL完全培养基重悬细胞，完全培养基为在DMEM/F12基础培养基中加入10 ng/mL bFGF，20 ng/mL人EGF，1×N2 supplement，1×B27 supplement，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素，0.4 U/mL肝素。血细胞计数板计数细胞密度，0.4%台盼兰染色，调整细胞密度约为2×105/mL，4 mL/瓶种入T50培养瓶中，放入条件在37℃、5%CO2孵箱中培养，次日每瓶细胞补充完全培养基1 mL，此后隔日半量换液一次。培养5～7 d后进行传代培养。每种测定至少进行三次独立的实验。

1.2.2 mGluR7siRNA合成及转染 mGluR7siRNA序列：Human mGluR7 siRNA (sense 5′-GAAGACACAGAAAGGAACUTT-3′,antisense 5′-AGUUCCUUUCUGUGUCUUCTT-3′) negative siRNA (NC-siRNA,sense 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,antisense 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)序列由上海吉玛公司合成。在转染siRNA前,将相应剂量的DMEM/F12基础培养基与Lipofectamine2000混合,并在室温下孵育5 min,再将相应剂量的基础培养液与siRNA混合,然后,室温下孵育5 min。将前两步混合液进一步混合,室温条件下孵育15 min。将siRNA- Lipofectamine2000混合物加入培养板,进行转染,继续培养至收获时间。

1.2.3 mGluR7表达载体的构建 pCMV2-GV146-GFP-mGluR7表达载体交由上海生工生物工程有限公司构建,pCMV2-GV146-GFP-mGluR7载体的转染：96孔板，细胞数量0.5～1.2×104,DNA 0.2 μg,TurboFectTM 0.4 μL；6孔板,细胞数量0.8～2.4×105,DNA 4 μg,TurboFectTM6 μL。在细胞接种一天后进行转染。

1.2.4 实时荧光定量PCR验证mGluR7在人胚胎NSCs中的表达 将传1代的NSCs按照200,000/孔种入6孔板中,设计实时荧光定量PCR引物,mGluR7-F：5′-CTGTTGGAGAGAGCGAGCAG-3′,mGluR7-R：5′-CAGAGAGGGTGAGGGGTCC-3′,选取β-actin作为内参,β-Actin-F：5′-TGGCACC CAGCACAATGAA-3′,β-Actin-R：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ进行反应,条件为：95℃,1 min预变性,95℃变性10 s,60℃退火,延伸40 s,重复40个循环,采用2-ΔΔCt的方法计算mGluR7的表达量。

1.2.5 MTT实验分析mGluR7对人胚胎NSCs细胞活力的影响 将传1代的NSCs按照20,000/孔种入96孔孔板中,且每孔为200 μL的单细胞悬液,常规培养48 h,后给予药物干预。实验分组：正常对照组、阴性对照组、siRNA(25和50 nM)组、拮抗剂MPEP(1,10和100 μM)组、激动剂DHPG(2,20和200 μM)组。各组3个复孔,分别于转染后24 h,48 h和72h检测人胚胎NSCs细胞的增殖活性。

1.2.6 神经球直径测量实验 将传1代的NSCs按照20,000/孔种入96孔孔板中,且每孔为200 μL的单细胞悬液,放入37℃,在5%CO2孵箱中培养48 h后给予药物干预。实验分组：正常对照组、阴性对照组、siRNA(25和50 nM)组、MPEP(1,10和100 μM)组、DHPG(2,20和200 μM)组。分别于转染后24 h,48 h和72 h利用Image-Pro Express(IPP)图像分析软件并照相,从而分析比较各组神经球直径的变化。

1.2.7 应用流式细胞术分析mGluR7对人NSCs细胞周期的影响 将传1代的NSCs按照200,000/孔种入6孔板中,每孔为2 mL的单细胞悬液,正常培养48 h后加药物干预。实验分组：正常对照组、阴性对照组、siRNA(50 nM)组、MPEP(100 μM)组、DHPG(200 μM)组,加入药物后继续培养。24 h后,收集各组单细胞悬液,PI染色,流式细胞术分析mGluR7对人NSCs细胞周期的影响。

1.2.8 应用流式细胞术分析mGluR7对人NSCs细胞凋亡的影响 细胞培养及分组同上,最后加入400 μL的1×binding buffer,反复混匀重悬细胞,再加5 μL Annexin V-FITC,于4°C避光染色15 min。最后加入10 μL PI染液,避光4°C染色5 min,采用流式细胞仪上机检测,分析mGluR7对人NSCs细胞凋亡的影响。

1.3 统计学方法

数据均以均数±标准误表示,应用SPSS 13.0进行数据分析,采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行显著性检验，以P<0.05表示有统计学意义。

2 实验结果

2.1 人胚胎NSCs的培养形态学观察

图1为人NSCs培养7d形成的神经球。将传一代的NSCs分散为单细胞悬液，种植96孔板中，培养7 d，NSCs可形成克隆，表明其具有自我更新能力，说明成功分离并培养了人胚胎脑皮质NSCs。

图1 原代培养7 d的人胚胎大脑皮质NSCs(Scale bars=50 μm)

2.2 过表达或沉默mGluR7后其表达变化

为了进一步研究mGluR7对人胚胎NSCs的作用，构建了mGluR7表达载体和mGluR7siRNA，并分别将其转染到人胚胎NSCs细胞中，使用qRT-PCR和Western Blot方法检测mGluR7在mRNA和蛋白水平的表达，结果发现与转染Control质粒相比，转染mGluR7表达载体的细胞中mGluR7mRNA与蛋白水平的表达均显著上调。转染mGluR7siRNA后的细胞中mGluR7mRNA与蛋白水平的表达均显著下调，差异具有统计学意义(见图2，P<0.01)

图2 在人NSCs中过表达或沉默mGluR7后其表达变化

注：A：mGluR7在mRNA表达水平变化；B：mGluR7在蛋白表达水平变化。*与NC-siRNA(阴性对照)组比较P<0.01，#与Control(空载体)组比较P<0.01n=3。

2.3 mGluR7对人NSCs和神经球增殖的影响

应用MTT比色分析法，初步分析了mGluR7对人NSCs增殖的影响。与对照组相比较，转染mGluR7表达载体在分别处理24 h，48 h和72 h后均促进NSCs增殖；而siRNA(50nM)在分别处理24 h，48 h和72 h后均抑制NSCs的增殖(P<0.01，见图3)。同样，转染mGluR7表达载体在分别处理24 h，48 h和72 h后均促进人神经球增殖；而siRNA(50nM)在分别处理24 h，48 h和72 h后均抑制人神经球的增殖(P<0.01，见图4)。

图3 mGluR7对人NSCs增殖的影响(MTT比色分析)

注：A：转染mGluR7过表达载体24、48、72 h时促进NSCs增殖；B：转染mGluR7siRNA(60nM)24、48、72 h时抑制NSCs的增殖(NC-siRNA代表阴性对照)。*表示P<0.01，n=3。

图4 mGluR7对人神经球增殖的影响(神经球直径测量)

注：A：转染mGluR7过表达载体24、48、72 h时促进神经球增殖；B：转染mGluR7siRNA(60nM)24、48、72 h时抑制神经球的增殖(NC-siRNA代表阴性对照)。*表示P<0.01，n=3。

2.4 转染mGluR7表达载体对人NSCs周期的影响

将培养的神经球用药物处理24 h后，消化分散为单个细胞，应用流式细胞仪检测细胞周期。结果显示，对3次结果进行分析，结果显示，过表达mGluR7后，与对照组相比G1/G0期和细胞比率显著下降，S期细胞比率显著上升，mGluR7过表达促进了细胞G1到S期转化，差异具有统计学意义(见图5与图6，P<0.01)。mGluR7可能诱导更多细胞跨过G1/S期节点，促进NSCs的DNA复制和有丝分裂加快，NSCs的增殖数量增加。

图5 流式细胞仪检测人NSCs的Control组和mGluR7组周期图谱

图6 转染mGluR7表达载体对人NSCs细胞周期的影响

注：*表示P<0.01，n=3。

2.5 沉默mGluR7对人NSCs细胞周期的影响

将mGluR7干扰RNA及其NC-siRNA分别转染至人NSCs细胞中，通过流式细胞术观察mGluR7siRNA对细胞周期的影响。结果表明，与阴性对照组相比，转染mGluR7siRNA组其G1/G0期细胞比率升高，S期细胞比率下降，这说明mGluR7siRNA将人NSCs细胞阻滞在G1/G0期(见图7与图8，P<0.01)。

图7 流式细胞仪检测人NSCs的NC-siRNA组和mGluR7siRNA组周期图谱

图8 转染mGluR7siRNA对人NSCs周期的影响

注：*表示P<0.01，n=3。

2.6 mGluR7对人NSCs细胞凋亡的影响

应用流式细胞术对转染mGluR7后的人NSCs进行细胞凋亡的检测，转染48 h后，对细胞进行AnnexinV-FITC和PI处理，正常细胞为FIPC与PI双阴性的细胞，在图9中即为左下象限内的细胞；而早期凋亡细胞为FIPC阳性，PI阴性的细胞，为图9中右下象限内的细胞；晚期凋亡细胞既能够被FIPC标记上，又能够被PI标记上，为FIPC与PI双阳性，即右上象限内的细胞。在对三次平行实验进行统计分析，我们发现mGluR7过表达组与对照组相比，早凋晚凋均显著下降，具有统计学差异(见图10，P<0.01)。

图9 流式细胞仪检测人NSCs的Control组和
mGluR7组凋亡图谱

图10 转染mGluR7表达载体对人NSCs凋亡的影响

注：*表示P<0.01，n=3。

2.7 沉默mGluR7对人NSCs细胞凋亡的影响

将mGluR7siRNA和NC-siRNA转染至人NSCs细胞中，并用流式细胞仪对凋亡进行检测，结果显示，转染mGluR7siRNA能够显著诱导人NSCs的早凋和晚凋(P<0.01，见图11与图12)。

图11 流式细胞仪检测人NSCs的NC-siRNA组和mGluR7siRNA组凋亡图谱

图12 转染mGluR7siRNA对人NSCs凋亡的影响

注：*表示P<0.01，n=3。

3 讨论

3.1 mGluR7可促进体外培养的人NSCs增殖

神经干细胞(NSCs)是存在于哺乳动物的中枢神经系统(CNS)内具有自我更新及多潜能特性的细胞，可以在哺乳动物胚胎和成年大脑中分离[9]。研究发现，成年哺乳类CNS侧脑室的室下区和海马齿状回的颗粒下区内终生存在着神经干细胞，正常情况下处于静止的非活化状态[10]。神经损伤是临床上最常见的严重危害人类健康的疾病之一，由于神经元大量死亡和丢失，导致一系列的严重神经功能障碍，尚无有效的治疗方法，给社会及家庭带来严重负担。近年来，神经干细胞的研究用为CNS疾病的治疗带来了曙光，神经干细胞治疗已经被广泛认为能改善脑缺血、神经损伤和神经变性紊乱疾病后的神经功能[11]。目前，人们逐渐的对关于信号因子调控神经干细胞的增殖和分化有了浓厚的兴趣。据报道，神经递质受体可能调控成人CNS的神经发生[12]。谷氨酸是CNS中的一个主要的兴奋性神经递质，它可能与神经发生相关[13]。脑损伤涉及谷氨酸兴奋性中毒，例如脑缺血和癫痫，但是它们也能刺激神经发生[14]。谷氨酸受体信号可能调控脑损伤后的神经发生。代谢型谷氨酸受体(mGluRs)属于G蛋白藕联受体家族，可能调控人大脑神经干细胞的增殖。

本小组前期研究发现，利用激动剂激活mGluR7可以通过激活MAPKs信号转导通路来促进体外培养的大鼠NSCs的存活、增殖和分化[15]。也有研究表明[16]，mGluR7选择性激动剂AMN082能抑制疼痛引起的炎症和切口痛引起的敏感性。这说明mGluR7在NSCs的增殖过程中扮演着非常重要的角色，可能通过影响多条信号通路发挥作用，因此有必要丰富mGluR7对人胚胎大脑NSCs增殖的影响。

siRNA是一个目前流行的基因敲除工具，它能通过对目的mRNA序列特异性降解来抑制基因表达，在这个实验中我们应用siRNA干扰特异性的沉默mGluR7基因表达。为了证明mGluR7对神经干细胞增殖的影响，我们同时应用了mGluR7过表达载体以及siRNA干扰技术处理人胚胎NSCs，分析其对细胞增殖的影响。研究发现，mGluR7过表达载体能增加体外培养的人的NSCs的细胞活力和神经球的大小。相反，mGluR7siRNA降低了NSCs的细胞活力和神经球的大小。这些研究结果表明，mGluR7可促进体外培养的人胚胎皮质NSCs的增殖。

3.2 mGluR7上调人NSCs的CyclinD1表达影响细胞周期

哺乳动物细胞周期中的G1期是细胞对环境信号反应从而决定细胞增殖、分化、衰老和存活命运的唯一时期[17]。重要的细胞周期调节子包括D型的Cyclins-Cdk4和Cdk6蛋白激酶复合体，它们支配通过细胞周期G1期的细胞进程[18]。三种D型Cyclin(D1,D2和D3)的表达在细胞周期和不同的组织特异性部位上下波动，然而Cdk4和Cdk6在细胞周期中的表达是稳定，这些表明不同的D型Cyclins的角色在调控细胞周期变更过程中是关键的因素[19]。CyclinD1和D2涉及神经系统的发育。缺乏CyclinD1的老鼠显示神经发育异常和视网膜发育不全，而CyclinD2缺乏的动物有小脑缺陷[20]。近来的研究表明CyclinD1在胚胎发育过程中调控神经干细胞的增殖是非常重要的，而CyclinD2在成年脑中调节神经干细胞增殖时更为重要[21]。

在这个研究中，我们通过上调和沉默mGluR7的表达分析其对NSCs细胞周期的影响。结果显示，过表达mGluR7后，与对照组相比G1/G0期和细胞比率显著下降，S期细胞比率显著上升，mGluR7过表达促进了细胞G1到S期转化，与之对应的是，沉默mGluR7的表达，G1/G0期细胞比率升高，S期细胞比率下降，mGluR7siRNA将人NSCs细胞阻滞在G1/G0期。这说明mGluR7可能诱导更多细胞跨过G1/S期节点，驱使更多的细胞进入S期，促进NSCs的DNA复制和有丝分裂加快，NSCs的增殖数量增加，促进NSCs增殖。