99Tcm-MAG3-RRL肿瘤靶向肽的标记和性质鉴定

2020-06-30杜毓菁段小江王荣福

核化学与放射化学 2020年3期

杜毓菁，闫平，陈钊，姜巧，段小江，王荣福,2,*

1.北京大学第一医院核医学科，北京 100034；2.北京大学国际医院核医学科，北京 102206

多肽类显像剂的显像应用和化学开发一直都是核医学和核放射化学的研究重点[1-3]。一般来说，小分子多肽具有易于人工合成、可控性高、分子量小、活性高、毒性低的优点，故具有较好的临床转化前景，可被应用于各种核素的标记[4-5]。99Tcm可发射141 keV的纯γ射线，同时化学价态多样，从钼锝发生器获取较为便捷，所以是多肽核素标记的常用核素。精氨酸-精氨酸-亮氨酸(Arg-Arg-Leu, RRL)是一种经噬菌体文库筛选并验证对肿瘤新生血管内皮细胞[5]和各种肿瘤细胞同时具有特异靶向性的寡肽序列[6-7]，其可被131I[8]、99Tcm [9]、68Ga[10]等核素标记。原有RRL多肽的序列极难被99Tcm标记，本课题组根据文献[11]在其氨基末端添加甘氨酸-甘氨酸-(D)丙氨酸-甘氨酸(Gly-Gly-(D)Ala-Gly)四肽以进行修饰，所形成天然穴状结构可螯合99Tcm。该法标记率为70%～80%，放射化学纯度在90%以上[12]。但是该直接标记的方法难以满足实际临床转化的标准，故本工作拟用双功能螯合剂巯基乙酰基三甘氨酸(MAG3)连接多肽，探究其提高核素标记率的可能并对其体外稳定性进行评估。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

SMA3000型紫外分光光度计，北京华大基因研究中心；RM905型放射性活度仪，中国计量科学研究院；FT-163 γ井型计数器，北京核仪器厂；BS110S电子天平，精度0.000 1 g，德国Startorius公司；pH测量计，意大利Hanna公司；电热恒温水浴锅，上海医疗器械三厂；Tetras多肽合成仪，美国CreoSalus公司；Sep-pak C18固相萃取小柱，美国Waters公司。

MAG3-多肽，自行设计，委托北京中科亚光科技有限公司合成并纯化，相对分子质量为1 535.63，纯度为98.94%；无水SnCl2，北京伊诺凯公司；Na99TcmO4溶液，北京原子高科股份有限公司；NaHCO3、丙酮、正辛醇、氨水(分析纯)等，购自北京化工厂；L-半胱氨酸(纯度≥99.0%)，牛血清白蛋白粉末(纯度97%)，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 MAG3-多肽的合成

RRL为核心功能区的十六肽氨基酸序列为Gly-(D-Ala)-Gly-Gly-Lys-(D-Ser)-(D-Ser)-Cys-Gly-Gly-Arg-Arg-Leu-Gly-Gly-Cys，其中Cys-Cys成环。实验设计将羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)-MAG3偶联在多肽Gly末端的氨基上，从而形成MAG3-多肽复合物。在北京中科亚光科技有限公司的协助下，采用下列技术路线：首先合成S-乙酰基巯基乙酰-N-羟基丁二酰亚胺(SATA)，即巯基乙酸和乙酸酐(摩尔比为1∶1.1)在室温下反应4 d，反应产物以减压蒸馏(115～125 ℃、267～400 Pa)纯化，得到高纯度的乙酰化巯基乙酸，然后将75 mmol乙酰化巯基乙酸与75 mmol NHS溶解于150 mL二氧杂环乙烷中，在4 ℃下与75 mmol二环己基碳二亚胺(DCC)反应16 h，过滤去除二环己脲，溶剂经真空冻干后用异丙醇2次重结晶而得到SATA。然后采用自动多肽合成仪常规固相法合成目标多肽，并在合成过程中直接在其N端连接3个甘氨酸，且在最后一个氨基酸接完后去保护，加入SATA、二异丙基乙胺(3 mol/L DIEA)及1-羟基，苯并，三氯唑四甲基六氟磷酸盐(HB-TU)、1-羟基苯并三唑(HOBT)反应60 min，比例为1∶3∶7∶3∶3，茚三酮反应检测为黄色即可。然后用N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷交替洗6次抽干。把切割液(1 mL乙二硫醇、1 mL苯甲硫醚、68 mL三氟乙酸、0.5 g苯酚、0.4 mL H2O、0.1 mL三异丙基硅烷)倒入树脂中，反应3～4 h后抽滤，用乙醚沉淀、离心4次，最后晾干，纯化得RRL-MAG3复合物，粗品到纯品大概回收率是10%～20%。产物经HPLC和质谱鉴定，其中HPLC条件为：流动相A液为0.05%(体积分数，下同)三氟乙酸的2%乙腈，B液为0.05%三氟乙酸的90%乙腈，流速为1.0 mL/min，梯度为第1—20 min，B液从5%—25%。

1.3 99Tcm标记

1.4 体外稳定性的测定

取经纯化的99Tcm-MAG3-RRL各100 μL分别加入2倍体积的生理盐水和50%牛血清蛋白(BSA)中，分别于室温和37 ℃下放置1、2、4、6 h，然后取少量样品用纸层析法测定其放射化学纯度。

1.5 半胱氨酸置换实验

取100 μL浓度分别为100、200、300、400、500 mmol/L的半胱氨酸溶液，分别加入纯化后50 μL(1.85 MBq)99Tcm-MAG3-RRL混匀后，37 ℃温育1 h，再同前述纸层析法(展开剂为丙酮)计算半胱氨酸对99Tcm-MAG3-RRL中99Tcm的置换率。对照组使用等体积的生理盐水。计算公式如下：半胱氨酸置换率(%)=丙酮展开剂前沿放射性计数/丙酮展开剂纸层析总放射性计数×100%。

1.6 脂水分配系数的测定

在1.5 mL离心管中同时加入500 μL正辛醇和480 μL磷酸盐缓冲液(PBS)，再取20 μL99Tcm-MAG3-RRL加入该管，用封口膜密封。充分振荡1 min后高速离心5 min，静置10 s。用移液枪分别从有机相和水相各取样100 μL液体，并连同枪头置于干净的放免管中，分别测量其放射性计数，计算脂水分配系数 (lgP)。计算公式如下：lgP=lg(N(正辛醇)/N(PBS))。其中，N(正辛醇)和N(PBS)分别为所测正辛醇和PBS的平均放射性计数。

1.7 统计学方法

所有数据均以平均值±标准差表示。采用统计软件SPSS 20.0，多组间比较采用单因素方差分析，若P<0.05则认为有显著统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 MAG3-多肽的合成和标记结果

图1 MAG3-RRL HPLC分析结果Fig.1 MAG3-RRL HPLC analysis results

图2 MAG3-RRL MS分析结果Fig.2 MAG3-RRL MS analysis results

2.2 MAG3-多肽的体外稳定性结果

临床多肽标纪药盒一般多用可注射生理盐水稀释，故本工作根据临床实际情况按室温下可注射生理盐水孵育和37 ℃牛血清白蛋白(BSA)孵育1 h来分别模拟评价标记药物的体外稳定性。纯化后的标记多肽在室温下生理盐水中放置1、2、4、6 h，放射化学纯度分别为94.00%±1.10%、93.43%±0.83%、93.27%±4.82%、91.06%±2.66%(n=3)。纯化后的标记多肽在37 ℃下50%BSA中放置1、2、4、6 h，放射化学纯度分别为97.10%±0.27%、96.16%±0.33%、96.26%±0.15%、94.27%±1.14%(n=3)，结果示于图4。图4结果显示，99Tcm-MAG3-RRL在生理盐水和50%BSA中放置6 h以内的稳定性较好，放化纯均在90%以上，其中在50%BSA中的稳定性更好。姚宁等[24]报道，99Tcm-RRL标记物在室温生理盐水和37 ℃人血清中，其放射化学纯度24 h内均大于93%。赵倩等[25]也有类似报道，在室温/37 ℃的生理盐水和正常人血清两种介质中共孵育 1、2、4、6 h 后，99Tcm-RRL的放射化学纯度也始终大于93%，且正常人血清中的放射化学纯度在各个时间点均大于生理盐水，与本实验结果趋势相同。但是本实验中99Tcm-MAG3-RRL在生理盐水中的稳定性低于前述文献报道，提示MAG3的加入可能对多肽标记物在生理盐水中的稳定性有一定影响。

图3 pH、SnCl2用量、反应温度、反应总体积对标记率的影响Fig.3 Effect of pH, SnCl2 dosage, reaction temperature and total volume of reaction on labeling rate

●——50%BSA，37 ℃；■——生理盐水，常温图4 99Tcm-MAG3-RRL在生理盐水和50%BSA中的放射化学纯度Fig.4 Radiochemical purity of 99Tcm-MAG3-RRL in normal saline and 50% BSA

2.3 MAG3-多肽的半胱氨酸置换实验和lg P

由于生物体内含有一些游离的巯基化合物，与99Tcm标记物在体内竞争配合，体外半胱氨酸置换实验结果可以间接反映标记物在生物体内的稳定性。纯化后标记多肽在100 μL 100、200、300、400、500 mmol/L的半胱氨酸溶液中的置换率分别为0.41%±0.14%、0.45%±0.24%、0.53%±0.04%、0.55%±0.17%、0.57%±0.21%，生理盐水对照为0.41%±0.04%，无统计学差异(n=3,P>0.05)。结果提示：游离锝含量随半胱氨酸浓度增加而略有增加，在500 mmol/L半胱氨酸溶液下增加约0.16%。这表明99Tcm-MAG3-RRL的体内稳定性可能较好，不易脱锝。原因可能是因为MAG3对99Tcm的螯合能力比较强，不易受半胱氨酸的影响。99Tcm-MAG3-RRL的脂水分配系数lgP=-0.15±0.01(n=3)，结果显示药物有一定水溶性。一般亲脂性结构更容易与细胞靶点蛋白结合，较强的水溶性虽然利于机体代谢，但是使得标记多肽在体内循环时间过短，不利于在肿瘤处更好富集[25]。总体而言，小分子多肽在体内的代谢分布易于优化[26-28]。有学者[29-30]报道用PEG修饰的多肽探针对标记率、稳定性影响较小，且同时能改善水脂分配，对于包裹药物及体内的长时间循环提供了良好的条件。