纤维蛋白显像剂131I-YSSCREKA肽的制备及对早期血栓定位的研究

刘 敏，申镐源，马 欢，庞小溪，霍 焱，赵光宇，孙宏伟，王荣福，张春丽

北京大学第一医院 核医学科，北京 100034

血栓栓塞性疾病，如心肌埂塞、脑中风和肺栓塞等在全球的病死率居高不下。约一半的深静脉血栓(deep venous thrombosis, DVT)形成后会脱落，是导致肺动脉血栓栓塞的主要原因。DVT年发病率约0.1%，最常发生于小腿和大腿深静脉内，但也可发生在上肢深静脉、内脏静脉甚至腔静脉中[1]。早期准确定位血栓位置可预防血栓脱落造成栓塞，对DVT患者有重要的临床意义。

静脉血栓核素显像分为非特异(如99Tcm-MAA)和特异(如抗纤维蛋白抗体、抗血小板抗体、RGD肽等)放射性核素显像。由于抗体在血液循环时间较长、在肺内的放射性聚积时间较长，因此临床应用受限。而小肽段的显像剂可从血液循环中很快被清除。CREKA肽由Simberg等[2]通过噬菌体展示技术筛选获得，可特异性结合纤维蛋白-纤维连接蛋白复合物，用于血栓形成早期、肿瘤微环境、动脉粥样硬化及心肌缺血再灌注研究[3-4]，含CREKA肽的纳米颗粒被报道用于急性血栓的核磁共振-超声-光声多模态成像研究中[5]。

本研究使用放射性核素131I标记含CREKA的八肽YSSCREKA，对其在动物模型中的早期血栓显像及体内生物分布进行研究。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

YSSCREKA八肽，上海吉尔生化有限公司；Sephadex G10柱颗粒，Pharmacia Biotech公司；牛血清白蛋白(蛋白质含量>98%)，中国医学科学院血液研究所；Na131I，北京原子高科股份有限公司；氯胺-T(化学纯，纯度98%)，上海国药集团化学试剂有限公司；正丁醇、无水乙醇、氨水(14.8 mol/L)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)及其他化学试剂均为分析纯，北京化学试剂公司。

RM905型放射性活度仪, 中国计量科学研究院; FT-163γ井型计数器，北京核仪器厂；FA1104电子天平,精度0.1 mg，上海精科天平公司; 微量加样器(10 μL、200 μL、1 mL)、5415D台式高速离心机，德国Eppendorf公司；MDF-U52V型-80 ℃超低温冰箱，日本SANYO公司；电热恒温水浴锅，上海医疗器械三厂；GZ-1多角振荡器，北京冰箱电机厂。

SD大鼠(200～300 g)、新西兰家兔(2～3 kg)，北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 131I-YSSCREKA的制备

1.2.1131I-YSSCREKA的标记及纯化 YSSCREKA多肽序列由上海吉尔生化有限公司通过Apex396全自动高通量多肽合成仪采用固相合成法合成，在CREKA肽的半胱氨酸端加酪氨酸及D型丝氨酸，形成Y-(D)Ser-(D)Ser-CREKA八肽，以便被131I碘化标记。用氯胺-T法进行131I标记。将200 μg YSSCREKA八肽溶于100 μL pH=7.4 的0.5 mol/L磷酸盐(PB)缓冲液中备用，在EP管中依次加入0.5 mol/L PB缓冲液50 μL、YSSCREKA八肽溶液25 μL、Na131I 溶液34.8～88.8 MBq(0.94～2.4 mCi) 50 μL、氯胺-T溶液, 使氯胺-T在混合液中的质量浓度为0.9 g/L，总反应体积不超过200 μL。将混合液放入振荡器，室温振荡5 min。将混合液通过经10%牛血清白蛋白饱和的Sephadex G10柱分离纯化，用pH=7.4的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，用EP管收集淋洗液，每管0.5 mL，依次测定各EP管的放射性计数，第一个计数高峰为131I-YSSCREKA。

1.2.2131I-YSSCREKA标记率、放射化学纯度及体外稳定性的测定 在混合物过Sephadex G10柱前及过柱后第一个计数高峰EP管中取少量待测液体，通过放射性纸层析法分别得到标记率及放射化学纯度。将纯化后的131I-YSSCREKA溶液置于室温(25 ℃)中，分别在0、1、3、6、24、48、72 h后通过放射性纸层析法测定其稳定性。展开剂为正丁醇、无水乙醇和0.5 mol/L氨水，体积比为5∶1∶2，131I-YSSCREKA的比移值(Rf)为0～0.1。

1.3 动物模型的建立

1.3.1SD大鼠静脉血栓模型的建立 SPF级SD大鼠25只，性别不限，5～10周龄，体重200～300 g，在屏障环境内用3%(质量分数，下同)戊巴比妥钠以50 mg/kg经腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台，备皮，打开腹腔，在腹腔后壁分离下腔静脉，在其外壁敷1.5 cm×0.1 cm质量分数为 25% FeCl3溶液的滤纸条约15 min，促进血管内壁血栓形成。取出滤纸，关闭腹腔，饲养2 d，期间饮用质量分数为0.5% NaI的水，封闭甲状腺及胃肠道粘膜。

1.3.2兔静脉血栓模型的建立 普通级新西兰家兔3只，性别不限，体重2～3 kg，用3%戊巴比妥钠以1 mL/kg经耳缘静脉注入麻醉，仰卧位固定于手术台，备皮，打开腹腔，在右肾下极以远约3 cm处寻找下腔静脉，在其内置入长约1.5 cm的单股螺旋铜丝，缝合血管，止血，观察下腔静脉血液回流通畅后关闭腹腔，饲养2 d，期间饮用质量分数为0.5% NaI的水，封闭甲状腺及胃肠道粘膜。

1.4 SD大鼠体内生物分布

取下腔静脉血栓造模后2 d的SD大鼠25只，随机分为5组，每组5只。前4组经尾静脉分别注射131I-YSSCREKA 3.7 MBq，分别于注射后6、12、20、48 h眼球取血100 μL后断颈处死大鼠。第5组为阻断组，在注射131I-YSSCREKA前30 min注射YSSCREKA肽50 μg，使无放射性的YSSCREKA肽与血栓位点结合，于20 h眼球取血100 μL后断颈处死大鼠。剥离血栓、取其主要脏器组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃壁、小肠壁、膀胱、股骨、肌肉、血液)并称重。γ井型计数仪测定各器官或组织的放射性计数。结果经过标准源校正，计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g)，并计算血栓与各组织器官的放射性比值，并对20 h未阻断组与20 h阻断组血栓对131I-YSSCREKA的摄取及血栓/血比值进行两独立样本t检验。

1.5 活体动物单光子发射计算机断层(SPECT)显像

兔血栓造模后2 d经耳缘静脉注入14.8 kBq/g131I-YSSCREKA，分别在注射后1、2、6、12、20、48 h行全身静态SPECT显像。SPECT仪采用高能通用准直器，采集时设置能峰360 keV，窗宽20%，1 000 k计数，矩阵128×128。在注射后20 h的血栓部位影像中勾画血栓处感兴趣区(region of interest, ROI)，在血栓上方的下腔静脉选取与血栓等面积的ROI，计算血栓部位与血液的放射性比值(T/B)。

2 结果与讨论

2.1 131I-YSSCREKA的标记率、放射化学纯度及稳定性

标记率、放射化学纯度及稳定性实验均重复3次。对标记产物采用放射性纸层析法测得的标记率为(77.2±1.1)%，经Sephadex G10柱纯化后放射化学纯度为(90.0±3.1)%。放射性比活度为(643.4±232.1) MBq/mg，放射性活度浓度为(29.3±11.3) MBq/mL。0～72 h131I-YSSCREKA在室温下磷酸盐溶液中的放射化学纯度示于图1，前24 h放射化学纯度大于80%，72 h放射化学纯度大于75%，说明131I-YSSCREKA在体外稳定性较高。

图1 131I-YSSCREKA的体外稳定性Fig.1 In vitro stability of 131I-YSSCREKA

2.2 SD大鼠体内生物分布

对每组下腔静脉血栓SD大鼠分别测量每克组织百分注射剂量率，计算血栓与其他组织放射性比值，生物分布结果列于表1。由表1可以看出：放射性示踪剂在血液中6 h时的放射性摄取为(0.44±0.05)%ID/g，12 h时为(0.12±0.04)%ID/g，血液清除较快；示踪剂在肾、膀胱积聚较高，在肝积聚低，表明131I-YSSCREKA主要经泌尿系统排泄。示踪剂在胃积聚较高，尤其12 h可达(0.74±0.19)%ID/g，但随时间延长放射性摄取逐渐下降。注射后不同时间血栓与各组织的放射性比值列于表2。由表2可以看出：血栓/肌肉维持较高的放射性比值，血栓/血液放射性比值随时间延长逐渐增高，在20 h时其比值达1.9，与48 h比值相近，但48 h血栓内131I-YSSCREKA放射性摄取仅为(0.04±0.01)%ID/g，在SPECT上与注射后20 h相比更加难以探测信号。与20 h未阻断组相比，20 h阻断组血栓对131I-YSSCREKA的摄取降低，t检验P=0.03；血栓/血放射性摄取比值从1.90降至0.85，t检验P<0.001。

表1 131I-YSSCREKA在SD大鼠体内的生物分布Table 1 Biodistribution of 131I-YSSCREKA in SD rat with vein thrombus

注：n=5

表2 在大鼠血栓模型中注射131I-YSSCREKA后不同时间血栓与各组织的放射性比值(T/NT)Table 2 T/NT of 131I-YSSCREKA in SD rat with vein thrombus at different time post injection

注：n=5

2.3 家兔血栓SPECT显像

箭头所指为血栓部位图2 家兔血栓模型注射131I-YSSCREKA 20 h后的SPECT显像Fig.2 SPECT images of rabbit with vein thrombus after 20 h 131I-YSSCREKA injection

131I-YSSCREKA肽在3只兔中均于注射后20 h左右血栓部位出现放射性聚集，至48 h时逐渐减淡至消失，与YSSCREKA肽在体内被酶降解有关。图2显示家兔注射显像剂131I-YSSCREKA后20 h的SPECT图像，箭头所指为血栓部位。20 h的血栓/血的T/NT值为1.36。

3 结 论

131I-YSSCREKA多肽在室温下进行标记反应，标记率为(77.2±1.1)%(n=3)，放射化学纯度为(90.0±3.1)%(n=3)，体外稳定性较好。131I-YSSCREKA对血栓有较高的选择性，心、肝、脾、肺、骨、肌肉等组织对其摄取低，131I-YSSCREKA有望成为一种新型早期血栓显像剂。