ELSD-HPLC同时测定乳癖消片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量*

韩吴琦，黄永丽

(1.开封市食品药品检验所，河南 开封 475000； 2.河南大学淮河临床学院，河南 开封 475000)

乳癖消片由鹿角、蒲公英、昆布、天花粉、鸡血藤、三七、赤芍、海藻、漏芦、木香、玄参、牡丹皮、夏枯草、连翘、红花15味药材组成，具有软坚散结、活血消痛、清热解毒的功效[1]，是国家基本药物、妇科常用药品。三七是乳癖消片的主药,为贵重药材。原质量标准三七含量测定仅以人参皂苷Rg1为指标，为保证临床用药安全有效，完善乳癖消片的质量标准，本实验建立了同时测定乳癖消片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的蒸发光散射检测器-高效液相色谱(ELSD-HPLC)方法，以便更好地控制其质量。

1 药品、试剂与仪器

乳癖消片，规格0.3 g，河南大学淮河临床学院自制，批号171211，180101，180201。对照品三七皂苷R1(批号110745-201017)、人参皂苷Rg1(批号110703-201027)和人参皂苷Rb1(批号110704-201122)，购自中国食品药品检定研究院。水为超纯水；乙腈为色谱纯；其他试剂为分析纯。UltiMate 3000液相色谱仪、Chromeleon7工作站，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；ELSD 2000ES蒸发光检测器，美国Alltech公司产品； KQ-600DE型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司产品；CPA225D 电子分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司产品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

安捷伦 XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃。ELSD检测：雾化室温度36 ℃，漂移管温度65 ℃，氮气流速25 psi/min。理论塔板数按人参皂苷Rg1计算应不得低于3 000。分别精密吸取对照品溶液10 μL、5 μL，供试品溶液10 μL，进行测定，用外标两点法对数方程计算，即得。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和人参皂苷Rb1对照品适量，用甲醇溶解制得分别含人参皂苷Rg12.0291 g/L、三七皂苷R10.5162 g/L和人参皂苷Rb11.8783 g/L的混合对照品储备液。精密量取上述混合对照品储备液10 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得含人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和人参皂苷Rb1对照品分别为0.202 9 g/L、0.0516 0 g/L和0.187 8 g/L的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品20片，精密称定，研细，精密称取约1.0 g，放入具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，水浴加热回流2 h，放冷后再称其质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备

按照乳癖消片处方和制剂方法，制得不含三七饮的样品，按照2.2.2项下方法，制备阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

分别精密吸取供试品、阴性样品和对照品的溶液各10 μL进样，结果供试品和混合对照品色谱中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的保留时间分别为 21，33，41 min，阴性样品对测定无干扰，分离度良好(R>1.5)。见图1。

1.三七皂苷R1；2.人参皂苷Rg1；3.人参皂苷Rb1；A.混合对照品； B.乳癖消片供试品 ；C.阴性样品图1 3种样品溶液的高效液相色谱图

2.4 线性关系考察

精密吸取对照品溶液1.0，3.0，5.0，8.0，10.0，15.0，20.0 μL，依次注入高效液相色谱仪，测定，求得人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和人参皂苷Rb1的回归方程分别为：Y=41 359 333.4X-335 919.8(r=0.996 6)，Y=13 984 339.7X-8 507.7(r=0.997 2)，Y=17 590 279.7X+172 539.6(r=0.998 1)；线性范围依次为0.202 9～4.058 0 μg，0.051 6～1.032 0 μg、0.187 8～3.756 0 μg。结果表明:三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1分别在0.051 6～1.032 μg、0.202 9～4.058 μg、0.187 8～3.756 0 μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液，重复进样6次，每次进样量为10 μL，测得三七饮片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的峰面积。结果：RSD分别为0.87%、1.68% 和0.17%。结果表明：仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批号乳癖消片样品6份，按2.2.2项下方法制备样品溶液，测定人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和人参皂苷Rb1的含量。结果：RSD分别为1.84%、1.48%和0.59%。结果表明：方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

按2.2.2项下方法制备1份供试品溶液，分别在制备0，2，4，8，10，12，24 h进样，每次进样10 μL，记录人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和人参皂苷Rb1的峰面积。结果：RSD分别为1.91%、1.64%和1.55%。结果表明：供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的样品(批号171211)6份，每份约0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入不同质量分数的混合对照品溶液(分别精密量取2.2.1项下的混合对照品储备液3，5，10 mL，置200 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得)50 mL，按2.2.2项下方法制成加样供试品溶液，测定人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和人参皂苷Rb1的含量，计算平均加样回收率。结果：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的平均回收率分别为97.73%、99.32%和99.03%，RSD分别为1.01%、1.37%和1.85%。结果表明：准确度良好。

2.9 样品含量测定

精密称取3批样品，按2.2.2项下方法制成供试品溶液，进样10 μL测定，结果见表2。

表2 样品含量测定结果n= 6

3 讨 论

《中华人民共和国药典》2015版一部中乳癖消片、乳癖消胶囊的含量测定项下供试品的处理方法操作繁琐，并且加热回流时间长，而本研究所用方法操作简便快速，分离效果好，结果准确，节约了时间和试剂，可以为修改相关标准提供参考。

《中华人民共和国药典》2015版一部和大多数文献[2-8]均以高效液相色谱色结合紫外分光光度法对乳癖消制剂中的人参皂苷类的成分进行检测，波长在末端吸收范围，容易造成复方制剂中其他的成分与待测成分之间互相干扰，影响色谱峰的分离效果和结果的准确性。ELSD检测器具有响应信号不受其官能团的影响的光学特性，响应信号更灵敏[9～11]，故本文选择HPLC-ELSD法同时测定制剂中贵重药材三七中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量。

本试验方法准确快速，重现性好，基线平稳，可同时测定乳癖消片中三七药材的皂苷类主成分的含量，可更好地控制药品质量，还可为含三七的复方药物制定质量标准提供参考。