一起肉鸡鸡毒支原体感染的检测与分析

李熙，张古月，龙剑，李润成

（1.长沙市农业综合行政执法局长沙 410013;2.湖南农业大学动物医学院长沙 410128）

鸡毒支原体（Mycoplasma Galliscepticum，MG）是危害养鸡业的重要病原，在鸡群具有较高的感染率[1-2]，我国鸡群感染阳性率可达到50%～80%[3]。鸡在4～8 周龄时对该病原最为敏感[4]。2019 年9 月，邵阳某鸡场一批50 日龄左右的鸡，6,000 羽左右，地面饲养，白天室外放养，晚上关入鸡舍。一天早晨突然发现死亡40 多羽，根据临床情况怀疑MG、副禽嗜血杆菌、大肠杆菌3 种病原中的一种或几种混合感染，采集病料样本进行了实验室的检测分析，并采取针对性防控措施控制了疫情，现报告如下：

1 材料

1.1 病料：鸡鼻窦黏液、喉气管及肝脏样本。

1.2 主要试剂：DNA 提取试剂盒（柱式病毒DNAout）、PCR 酶mix3.0，购于北京天恩泽生物科技有限公司；巧克力营养琼脂购自贝瑞特生物技术(郑州)有限责任公司。

2 方法

2.1 病鸡的临床、解剖观察

首先对发病鸡群进行临床观察，然后取3 只临床表现具有代表性的鸡，按常规方法进行解剖观察并记录。

2.2 细菌分离鉴定

用无菌接种环钩取鼻窦分泌物、肝脏样本，分别划线接种至巧克力营养琼脂，37 ℃温箱中培养36 h，观察细菌生长情况，如有优势菌落生长则进行进一步的细菌纯培养鉴定。

2.3 病毒检测

按照DNA 提取试剂盒说明书提取解剖鸡鼻窦、喉气管分泌物基因组DNA，然后用参照文献[5]合成的鸡毒支原体检测引物，以提取的基因组做为模板，进行PCR 检测。PCR 体系为：PCR Mix 25 μL、纯水21 μL、上游引物1μL、下游引物1 μL、模板2 μL。PCR 退火温度为50℃，PCR 完毕后进行产物的电泳鉴定，并将阳性产物送北京擎科生物技术有限公司进行序列测定。

2.4 防控

根据临床观察结果拟定初步方案进行防控，待实验室检测结果明确后再考虑是否需要制定新的防控措施。

3 结果

3.1 临床解剖观察结果

临床观察发病鸡群，有少量鸡存在一侧或两侧眼睛流泪或充满干酪样渗出物，失明（图1、2），但未发现明显甩头和呼吸异常。挤压死亡病鸡鼻孔可见大量黏液流出（图3），喉部有干酪样渗出物、气管内充满黏液（图4），其它病变不明显；单侧眼睛失明但尚未死亡的病鸡，发现除眼睛出现上述问题、鼻窦充满黏液外（图5），气管以及其它脏器均无明显病变。

图1、眼睛流泪

图2、眼睛充满干酪样物质

图3、鼻孔有黏液挤出

图4、气管内布满黏液

图5、鼻窦充满黏液

3.2 细菌分离鉴定

无菌操作取眼睛分泌物、鼻窦黏液划线接种巧克力营养琼脂，37℃培养48 小时。结果眼睛分泌物接种的培养基上仅长出几个大小不一的菌落，未分离到大量直径较大、灰白色、类似于大肠杆菌的菌落；鼻窦黏液接种的培养基上，除长出一些大小、形态不一的菌落外，无菌落形态一致的优势细菌生长，未见到小而半透明，针尖状，类似副鸡嗜血杆菌的小菌落[6]。

3.3 鸡毒支原体的PCR 检测

取鼻窦及气管分泌物提取DNA 基因组，并以提取的基因组为模板，采用参照文献[5]合成的MG 检测引物进行PCR 扩增，结果从3 个样本均扩增出了预期大小的特异性条带（图6）。

将阳性PCR 产物送北京擎科生物技术有限公司进行序列测定。结果来自3 个样本的序列同源性为100%，将其中1 个样本测出序列上传至GenBank，登录号为MN526743。该序列与Gen-Bank 登录的其它MG 菌株相应片段同源性见图7。由图可见从病料样本中测出的MG 脂蛋白序列与2016 年提交，来自中国病鸡肺脏的菌株QHDT-1（登录号：KY088075）具有100%的同源性。

图6、鸡毒支原体PCR 检测结果

图7、鸡毒支原体同源性比较图

3.4 防控

首先根据临床初步诊断结果，采用对MG、副鸡嗜血感染、大肠杆菌均有效的广谱抗生素多西环素，饮水添加饲喂，同时适当降低鸡群密度，3d 后，没有再出现死亡病例，也未见到眼睛失明病鸡数量的增加，但眼睛已失明的鸡未康复。实验室检测结果证明无明显副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌感染后，再改用对支原体有特效的泰万菌素饲喂4d。除已出现眼睛失明的病鸡外，没有再发现鸡群中出现类似异常情况。

4 讨论与分析

本文对一规模鸡场鸡群突然出现死亡、少量鸡只眼睛流泪、一侧眼睛失明的病例进行了临床和实验室检测。结果从眼睛分泌物仅培养出几个形态不一的菌落，表明样本中没有大量可生长于巧克力营养琼脂的细菌存在，说明该病例可能并非大肠杆菌引起的全眼球炎；从鼻窦黏液没有培养出形态一致，数量上具有优势的菌落，更未发现类似副鸡嗜血杆菌的菌落，同样可以排除副鸡嗜血杆菌引起的鸡传染性鼻炎。但从气管分泌物均检测到MG，可以推断该次鸡群出现发病应该主要是由MG 感染引起。结合临床使用主要针对支原体的药物，很快控制了疫情，进一步证明该次鸡群发病的主要原因。此外，测定的脂蛋白基因序列比对结果表明，样本中MG 与来自中国病鸡肺脏，2016 年提交至GenBank 的菌株QHDT-1 具有100%的同源性，该毒株在我国鸡群是否属于一个流行较广的毒株尚需进一步调查。

MG 除可通过鸡蛋传播[7]外，上呼吸道和黏膜是其自然感染的通道。其主要寄生在鸡的呼吸道和结膜表面，上呼吸道和结膜是气溶胶和飞沫中菌株进入机体的通道，免疫抑制和较差的环境条件或其他应激因素可能有助于诱发严重的MG 疾病[8]。因此鸡场做好饲养管理，提高鸡群健康水平，并且适当降低鸡群密度，在做好防寒工作的同时，尽量减少鸡舍空气中可伤害上呼吸道黏膜的氨气、硫化氢，以及可携带MG 的飞沫，对于MG 的防控具有非常重要的作用。此外，鸡MG 可产生耐药性[8]，有条件的鸡场可以考虑进行药物敏感性检测，选用敏感药物进行防控，如果未进行药物敏感性检测则建议选用2—3 种敏感药物轮换使用，以防MG 的耐药性影响疾病防控效果。