连翘酯苷A 对感染H9N2-AIV 小鼠的炎症基因水平表达的影响

盛楠，鲁冠杰，付岳，胡格

（北京农学院动物科学技术学院，兽医学（中医药）北京市重点实验室，北京 102206）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的季节性流行病导致动物大量死亡。呼吸系统受到AIV 攻击后，细胞因子早期的迅速分泌，对机体产生保护作用。但过度持续的刺激将导致病理改变，甚至危及生命。病毒感染机体后，特异性配体结合靶标，活化相关信号网络，密切级联的蛋白依次激活最终导致免疫因子的释放。连翘酯苷A(Forsythiaside，FTA)是连翘风干果实提取物，具有多种药理作用，已被广泛应用于疾病的研究。有学者发现，连翘悬浮提取物可以明显降低炎性肝损大鼠炎性因子的过表达[1]，提示我们连翘提取物具有预防损伤的潜力。基因水平的检测可以准确地反应出中药作用机体后的影响变化。因此,本试验通过基因水平，研究FTA 对感染H9N2-AIV 后小鼠的炎症基因水平表达的影响，探讨FTA 抗病毒的免疫作用机制与相关细胞因子的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

H9N2 型禽流感病毒效价为10-9；6～8 周龄Balb/c 小鼠（北京兴隆动物养殖厂）；小鼠IL-1β 检测试剂盒（酶联生物）；动物组织总RNA 提取试剂盒（天根）；UItra SYBR Mixture（江苏康为世纪）；cDNA 合成试剂盒（全式金）；连翘酯苷A（上海源叶生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 试验动物的处理及分组120 只小鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组；对照组小鼠滴鼻接种100 μL正常鸡胚尿囊液，其余各组滴鼻接种LD50含量的病毒尿囊液100 μL（约10-1.78）；低剂量组、中剂量组、高剂量组给予FTA，剂量分别20、40、80 mg/kg，连续7 d。分离饲养防止交叉感染。

1.2.2 细胞因子检测 在3、5、7、14 d 每组分别取3 只小鼠采血，离心取血清，按照小鼠IL-1β 试剂盒说明检测细胞因子。

1.2.3 实时荧光定量PCR 检测于第7d 各组随机选取3 只小鼠，采血后剖杀取肺组织提取总RNA，依照反转录试剂盒说明书操作，立刻进行反转录合成cDNA，引物序列为：MyD88-P1：5'-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3'；P2：5'-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3'；NF-κ B-P1：5'-CTAGAGCTGCTGGCCTTGTT-3'；P2：5'-TCTGGATTCGCTGGCTAATGG-3'；GAPDH-P1：5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'；P2：5'-GATGCAGGGATGATGTTC-3'。由上海生工合成后，进行实时荧光定量PCR 检测。

1.2.4 统计分析试验数据以均数± 标准差表示，采用t 检验分析各组数据，用#、*表示P＜0.05，即差异显著；用##、**表示P＜0.01，即差异极显著。

2 结果与分析

2.5 抗炎因子的变化

图1 小鼠感染H9N2-AIV 后IL-1β 变化

如图1 所示，与对照组相比，3—14d 中模型组IL-1β 表达极显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，第5—7d 时中剂量组与高剂量组IL-1β 表达极显著降低（P＜0.01）；第14d 时FTA 治疗后的3 组与对照组无明显差异，其中中剂量组与模型组具有极显著差异（P＜0.01）。

2.1 肺组织相关基因表达水平

2.1.1 肺组织中MyD88 的mRNA 变化 如图2 所示，与对照组相比，各组上游信号MyD88 基因表达极显著升高（P＜0.01）；FTA 治疗后，3 组表达量有所降低，与模型组相比具有极显著差异（P＜0.01）。

图2 肺组织中mRNA 表达量

2.1.2 肺组织中NF-κB 的mRNA 变化 如图3 所示，与对照组相比，模型组下游信号NF-κB 表达量极显著升高（P＜0.01）；FTA治疗后，3 组表达量降低，与模型组相比具有极显著差异（P＜0.01）；下游信号与上游信号表达趋势一致，且随着FTA 治疗量的增加，相关基因表达水平有所减弱。

3 讨论

图3 肺组织中mRNA 表达量

AIV 的大流行给现代禽业发展带来极大的威胁，尤其是由H9N2-AIV 引起的呼吸系统疾病越来越普遍。机体感染AIV 后，肺脏是最易受到侵害的靶器官，肺内部构成的“气血屏障”与细胞上的免疫受体在病理情况下发挥着重要作用。当病原体等外来物质刺激宿主细胞的相应受体时，适配体信号分子或转录因子被激活，活化后的下游信号转导启动促炎细胞因子，调控宿主细胞的抗病毒状态[2]。有研究发现，随着时间的推移细胞因子持续地增加发挥抗炎作用，早期的细胞因子分泌和抗体的快速产生可能是决定病症严重程度关键因素[3]，促炎细胞因子的适量产生是有益反应，而强烈的细胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6 等[4]）产生将造成细胞因子风暴，病毒诱导的过度免疫反应造成炎症浸润使组织破坏，最终导致发病率和死亡率的增加。

近年来，中药抗病毒的研究已经成为热点问题。与西药不同，单味中药便可以含有多种有效成分。FTA 作为一种有效的天然抗氧化剂，在抗病毒与抗损伤中表现出很好的治疗效果。有研究表明，FTA能减轻炎性损伤，其机制可能是通过抑制TLR4 受体依赖的MyD88—NF-κB 信号途径，减少炎症因子释放[5]。相关的分子学研究发现FTA 可以作用到病毒M1 蛋白，通过干预病毒颗粒蛋白形成最终限制病毒传播[6]。随着不断深入的研究发现，FTA 参与多种炎症通路的表达，通过抑制相应受体的激活，降低免疫因子的释放缓解机体免疫损伤反应，达到保护与治疗作用。本研究发现，H9N2-AIV 感染小鼠后，引起了MyD88 与NF-κB 基因的激活，继而造成IL-1β 持续大量的增加，导致机体炎性损伤；而经过FTA 治疗后，其基因表达水平与炎症因子分泌均呈现下降趋势。本研究表明，FTA 通过调控MyD88—NF-κB 基因表达水平，降低细胞因子的产生，减轻H9N2-AIV 所致的炎性损伤，提示我们FTA 具有一定的治疗作用。

综上所述，FTA 可减轻AIV 感染后的病理状态，其主要作用机制可是通过抑制MyD88—NF-κB 的基因表达，减轻炎症因子过度释放。而具体的信号网络激活途径还有待进一步探索，为临床使用中药提供更完善的依据。