响应面法优化锁阳水提取物提取工艺

王 玉 梅 乔 红 艳 王 勤* 宋 玉 霞

（1.河西学院，甘肃 张掖 734000；2.兰州祥灵医药有限公司，甘肃 兰州 730100）

锁阳是锁阳科（Cynomoriaceae）植物锁阳Cynomorium songaricum Rupr.的干燥肉质茎，俗称“不老药”，又名铁棒槌、锈铁棒、地毛球、羊锁不拉、乌兰高腰（蒙语），生长于土地缺乏有机质而富含盐分的干燥多沙地带，多寄生于蒺藜科Zygophyllaceae 白刺属Nityaria L.植物根部，为全寄生种子植物［1-2］，是河西走廊的道地药材之一［3-5］.具有补肾阳、益精血、润肠通便的作用，临床上主要用于腰膝痿软、阳痿精滑、肠燥便秘等症［6］.锁阳含有多种化学成分，如三萜类、甾体类、黄酮类、有机酸类及鞣质等［7-9］.没食子酸和原儿茶酸属于有机酸类，其中没食子酸具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的作用；原儿茶酸具有增加冠脉流量、降低心肌耗氧量的作用［10-12］.水煎煮法是中药传统的煎煮方法，近年来已有学者对锁阳中某类化学成分的提取工艺进行了研究，对于锁阳水提取物的研究也多是对其药效的评价，尚未见对其提取工艺的研究，故本试验以锁阳水提取物中没食子酸和原儿茶酸含量为响应值，运用响应面法优化锁阳水提取物提取工艺［13-16］，以期为锁阳的资源开发利用提供参考.

1 仪器与试剂

1.1 材料与试剂

锁阳，采自甘肃张掖临泽县，并经河西学院医学院王勤教授鉴定；对照品没食子酸（按含量90.1%计，批号110831-200803）、原儿茶酸（按含量97.9%计，批号110809-200102）购自中国食品药品检定研究院；乙腈、磷酸为色谱纯；水为怡宝纯净水.

1.2 仪器与设备

LC-20A 高效液相色谱仪，日本岛津公司，配置包括SPD-20AV 检测器、SIL-20AC 自动进样器、LC-20AD四元梯度泵、COT-20AC柱温箱及色谱工作站；KQ-500E型超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；电子天平FA2004，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HK-10B型500g摇摆式粉碎机，广州市旭朗机械设备有限公司；PT-124/85S 电子天平，福州华志科学仪器有限公司；202-0 型电热恒温干燥箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，金坛市东城新锐仪器厂.

2 方法与结果

2.1 色谱条件

图1 对照品色谱峰

图2 锁阳样品色谱峰

表1 流动相梯度洗脱条件

色谱柱：Hypersil ODS C18柱（250mm×4.6mm，2.5μm），流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）梯度洗脱，洗脱程序见表1，流速：1.0mL/min，柱温：35℃，检测波长：260nm，进样量：10μL.没食子酸、原儿茶酸对照品和样品溶液HPLC色谱峰见图1、图2.

2.2 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸对照品6.27mg，于5mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，超声处理10min，作为没食子酸对照品贮备溶液；精密称取原儿茶酸对照品5.47mg，于5mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，超声处理10min，作为原儿茶酸对照品贮备溶液；分别精密量取没食子酸对照品贮备溶液3mL和原儿茶酸对照品贮备溶液1mL，于50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，超声处理10min，制成每1mL分别含没食子酸75.24μg，原儿茶酸23.48μg的混合对照品溶液.4℃贮藏，备用.

2.3 供试品溶液的制备

取锁阳粉末约1.0g，（过二号筛），精密称定，置100mL 锥形瓶中，精密加入水30mL，回流提取2次，每次60min，合并提取液.精密量取上述水提液20mL，水浴浓缩至约5mL，转移至5mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，即得.

2.4 标准曲线的绘制

分别精密吸取2.2项下制备的混合对照品溶液2，6，10，14，18μL进样.按2.1项下色谱条件进样测定，分别以没食子酸、原儿茶酸色谱峰峰面积（A）对进样量（X/μg）进行线性回归，绘制标准曲线.得到没食子酸回归方程：y=2826954.74x-6745.35，R2=0.9999，进样量为2-18μL 时线性范围为0.15-1.35 μg；原儿茶酸回归方程：y=3392985.52x+1790.60，R2=0.9999，进样量为2-18μL 时线性范围为0.04-0.42μg.

2.5 单因素试验及结果

2.5.1 提取时间对锁阳水提取物中没食子酸、原儿茶酸提取效果的影响

固定液料比30∶1（mL/g）、提取次数2次，考察提取时间为30min、45min、60min、90min对锁阳水提取物中没食子酸、原儿茶酸提取效果的影响，结果见图3.试验数据表明，没食子酸，原儿茶酸含量随着提取时间的增加而增加，当提取时间为45min时，含量达到最大值，继续增加提取时间，含量变化不大，从节约能源、缩短生产周期等方面综合考虑，选定提取时间45min为最优提取时间.

图3 提取时间对锁阳水提物中没食子酸和原儿茶酸提取效果的影响

2.5.2 提取次数对锁阳水提取物中没食子酸、原儿茶酸提取效果的影响

固定液料比30：1（mL/g）、提取时间45min，考察提取次数为1次、2次、3次对锁阳水提取物中没食子酸、原儿茶酸提取效果的影响，结果见图4.试验数据表明，没食子酸，原儿茶酸含量随着提取次数的增加而增加，当提取次数为2次时，含量达到最大值，继续增加提取次数，含量变化不大，从节约能源、缩短生产周期等方面综合考虑，选定提取次数2次作为最优提取次数.

图4 提取次数对锁阳水提物中没食子酸和原儿茶酸提取效果的影响

2.5.3 液料比对锁阳水提取物中没食子酸、原儿茶酸提取效果的影响

固定提取时间45min、提取次数2次，考察液料比为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1对锁阳水提取物中没食子酸、原儿茶酸提取效果的影响，结果见图5.试验数据表明，没食子酸，原儿茶酸含量在液料比30：1时达到最大值，随着液料比的增加含量开始降低，可能是可溶性物质溶出太多，造成杂质含量增加.综合考虑提取液总量与提取效率等方面的因素，选定30∶1作为最优液料比.

图5 液料比对锁阳水提物中没食子酸和原儿茶酸提取效果的影响

2.6 响应面试验及结果

2.6.1 响应面分析因素与水平的选取

在单因素试验的基础上，选取提取时间、提取次数、液料比3个主要因素，运用Box-Behnken的中心组合试验设计原理进行试验，并利用响应面法对锁阳水提取物提取工艺进行优化，采用Design-Ex⁃pert10.0.1统计软件进行试验设计与回归分析.试验因素和水平见表2.

2.6.2 响应面分析试验设计方案

根据Box-Behnken 的组合设计原理，采用Design-Expert10.0.1 软件设计3 因素3 水平共15 个试验，其中中心点重复5次试验，试验设计与结果见表3.

表2 响应面试验因素与水平

表3 响应面分析方案及结果

2.6.3 响应面回归模型的建立与分析

采用Design-Expert10.0.1 软件对表3 中的数据进行二次多项式回归拟合并对响应面进行方差分析.对没食子酸，分析结果见表4，回归模型P小于0.01，说明模型极显著.回归方程为没食子酸含量（P1）=0.98+0.024A+0.089B+0.029C-8.250×10-3AB-0.039AC+0.076BC-0.15A2-0.26B2-0.15C2，相关系数R2=0.9100，回归方程显著.对原儿茶酸，分析结果见表5，回归模型P小于0.01，说明模型极显著.回归方程为原儿茶酸含量（P2）=0.18+3.125×10-3A+0.035B+5.750×10-3C+8.250×10-3AB-0.015AC+0.014BC-0.019A2-0.057B2-0.031C2，相关系数R2=0.9010，回归方程显著.由分析结果可知，回归方程可较好地描述各因素与没食子酸、原儿茶酸含量之间的真实关系，可利用该回归方程确定3个参数的最佳水平.

表4 响应面方差分析-没食子酸

表5 响应面方差分析-原儿茶酸

2.6.4 响应面图分析

响应面曲面可较直观地反映各因素及两两因素的交互作用对响应值的影响.锁阳水提取物中没食子酸、原儿茶酸提取响应面3D图谱及等高线见图6至图11.由响应面图判断，响应面的开口向下，且随着各因素的增大，响应值也增大，当响应值增大到最大值后，随着因素的增大，响应值逐渐减小.等高线图同一曲线上没食子酸、原儿茶酸得率相同，图形中心得率最高.两因素之间交互作用可以直观地通过中心区域的等值线圆形程度和位置来判断，等高线圆形形状越扁，且越偏离中心位置交互作用越大，对没食子酸、原儿茶酸得率的影响越显著.

图6 提取时间和提取次数对没食子酸含量影响的响应面立体图和等高线图

图6、图7 分别是提取时间和提取次数对锁阳水提取物中没食子酸、原儿茶酸含量影响的响应面图.保持提取次数为一定值时，没食子酸、原儿茶酸含量随着提取时间的增加而升高，达到峰值以后又逐渐降低；保持提取时间为一定值时，随着提取次数的增加，没食子酸、原儿茶酸含量也是先升高后降低.等高线图呈扁圆形，表明提取时间和提取次数两个因素间具有较强的交互作用.

图8、图9 分别是提取次数和液料比对锁阳水提取物中没食子酸、原儿茶酸含量影响的响应面图.保持提取次数为一定值时，没食子酸、原儿茶酸含量随着液料比的增加而升高，达到峰值以后又快速降低；保持液料比为一定值时，随着提取次数的增加，没食子酸、原儿茶酸含量也是先升高后降低.等高线图呈扁圆形，表明提取次数和液料比两个因素间具有较强的交互作用.

图7 提取时间和提取次数对原儿茶酸含量影响的响应面立体图和等高线图

图8 提取次数和液料比对没食子酸含量影响的响应面立体图和等高线图

图9 提取次数和液料比对原儿茶酸含量影响的响应面立体图和等高线图

图10、图11 分别是提取时间和液料比对锁阳水提取物中没食子酸、原儿茶酸含量影响的响应面图.随着提取时间和料液比的增加，没食子酸、原儿茶酸含量也是先升高到最大值，随后又下降，表明提取时间和液料比对没食子酸和原儿茶酸含量的影响也是比较大的.但是等高线图略呈扁圆形，表明提取时间和液料比两个因素间的交互作用较弱.

图10 提取时间和液料比对没食子酸含量影响的响应面立体图和等高线图

图11 提取时间和液料比对原儿茶酸含量影响的响应面立体图和等高线图

通过对回归方程微分求解，所得的锁阳水提取物中没食子酸、原儿茶酸提取最优工艺参数为：提取时间45.86min、液料比31.35mL/g、提取次数2.19次，此条件下，没食子酸和原儿茶酸提取量的预测值分别为0.992mg/g、0.189mg/g.由表4和表5还可以看出，影响锁阳水提取物中没食子酸、原儿茶酸含量的各因素按照影响大小排序依次为提取次数＞液料比＞提取时间，其中提取次数的影响最大.

2.7 验证性试验

为了检测试验结果与真实情况是否相一致，根据优化结果进行了验证性试验，考虑到实际操作的可行性，将工艺条件修改为：提取时间45min、液料比30∶1（mL/g）、提取次数2次.在此条件下进行5次平行试验，得到没食子酸平均含量0.986mg/g，与预测得率的相对误差为0.61%；原儿茶酸平均含量0.185mg/g，与预测得率的相对误差为2.70%.证明模型理论预测值与实际值拟合效果良好，优化结果可靠.

3 结论

响应面法是集统计学、计算机科学和数学建模于一身的统计和优化方法，其具有较高的试验精确度、并能明显减少试验次数，且建立的数学模型预测性较好，能够反映各因素与响应值之间的关系［13］.响应面法虽然广泛用于中药提取工艺的优化，但关于锁阳水提取物提取工艺的优化鲜见报道.本研究采用水回流提取法，以锁阳水提取物中没食子酸和原儿茶酸含量为响应值，通过响应面法优化锁阳水提取物提取工艺.单因素试验结果表明，提取时间、提取次数、液料比对锁阳水提取物中没食子酸、原儿茶酸含量的影响作用都比较明显.在单因素试验的基础上，建立了3 因素3 水平的Box-Behnken 响应面分析方法，对锁阳水提取物提取工艺进行优化以及验证.结果表明，各因素对锁阳水提取物中没食子酸、原儿茶酸含量的影响大小顺序为：提取次数＞液料比＞提取时间.优化的提取工艺条件为：液料比30∶1（mL/g）、提取时间45 min、提取次数2 次. 没食子酸含量实测值0.986mg/g，与预测值的相对误差为0.61%；原儿茶酸含量实测值0.185mg/g，与预测值的相对误差为2.70%.因此，本试验建立的二次多项回归方程模型能够较好地预测各因素与响应值之间的关系，能够为锁阳的进一步开发利用提供一定的理论基础.