黄芩主要成分黄芩甙的测定及体外抑菌作用研究

叶英剑 李启彬 刘园园

作者单位：463000 河南 驻马店，驻马店市食品药品检验所

抗生素的使用虽使众多细菌感染性疾病得到了有效控制，但由于抗生素的不合理使用导致了耐药菌株的增加，降低了现有抗生素的效率［1］，尽管专家学者仍在不断努力研制新的抗生素，但新抗生素的研发生产明显跟不上耐药菌株形成的速度［2］。虽然我国从20世纪40年代就开始进行传统中药的体外抑菌实验，证明了大批中药对细菌的抑制作用［3］，且近年来，随着中医学的不断发展，中药汤剂、湿润烧伤膏等中药制剂在预防和控制细菌感染性疾病方面也发挥了积极作用［4-5］。但由于中药成分的复杂性、抑菌实验方法的差异性以及中药抑菌作用统一判定标准的缺乏等原因，人们对中药抑菌作用的认识还存在明显误区。为进一步发掘中药的抑菌作用，为中药抑菌作用的应用提供理论依据，笔者鉴于黄芩在临床中的应用较为广泛，且现代药理学研究证实其具有抑菌作用［6］，但对其有效成分提取物的测定及抑菌性能的研究较少，遂于本研究中对其有效分黄芩甙的测定及抑菌作用进行了研究分析。

1 主要实验材料及设备

中药黄芩：购于驻马店炎黄大药房；枯草杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、沙门氏杆菌、绿脓杆菌菌种：马同长中医药生物研究所提供；黄芩甙标准品：中国药品生物制品检定所提供；氢氧化钠、无水乙醇：天津市北方天医化学试剂厂提供；蛋白胨、牛肉浸膏、琼脂：北京奥博星生物技术有限责任公司提供；自动平衡离心机、数显恒温水浴箱：江苏省金坛市医疗仪器厂提供；紫外可见分光光度计：上海申安医疗器械厂提供。

2 实验方法

2.1 黄芩甙的提取

煎煮法：黄芩打磨成粉后，取黄芩粗粉40 g溶于10倍量蒸馏水中，微沸加热2 h，滤出提取液；而后加入8倍量蒸馏水，再次微沸加热2 h，滤出提取液；合并两次提取液并过滤，滤液浓缩干燥成干浸膏；用少量蒸馏水溶解干浸膏，加热至40℃，滴加2 mol／L盐酸，将其pH值调节至约1.5，40℃恒温静置60 min，室温静置12 h；4000 r／min离心20 min，倒出上清液，蒸馏水洗涤沉淀2次后，55℃下干燥至恒重。

温浸法：取黄芩粗粉40 g溶于10倍量蒸馏水中，80℃水浴加热2 h，滤出提取液；而后加入8倍量蒸馏水，再次80℃水浴加热2 h，滤出提取液；合并两次提取液后按照煎煮法提取黄芩甙。

超声波法：取黄芩粗粉40 g溶于10倍量蒸馏水中，超声提取50 min，滤出提取液；而后加入8倍量蒸馏水，再次超声提取50 min，滤出提取液；合并两次提取液后按照煎煮法提取黄芩甙。

加碱温浸法：取黄芩粗粉40 g溶于10倍量pH值为10的氢氧化钠溶液中，80℃水浴加热2 h，滤出提取液；而后加入8倍量pH值为10的氢氧化钠溶液，再次80℃水浴加热2 h，滤出提取液；合并两次提取液后按照煎煮法提取黄芩甙。

醇提法：取黄芩粗粉40 g溶于10倍量70%乙醇溶液中，回流提取2 h，滤出提取液；而后加入8倍量70%乙醇溶液，再次回流提取2 h，滤出提取液；合并两次提取液后按照煎煮法提取黄芩甙。

2.2 黄芩甙的含量测定及药液制备

称取干燥黄芩甙样品25 mg置于50 mL容量瓶中，加入50%乙醇40 mL，水浴加热至完全溶解，冷却至室温后再次加入50%乙醇至50 mL；微量加液器吸取2.5 mL溶液置于100 mL容量瓶中，50%乙醇定容，紫外可见分光光度计测定吸光度值。

经对比分析显示，加碱温浸法为黄芩甙的最佳提取方法，故再次采用加碱温浸法提取黄芩甙 （方法同上）。将提取所得的黄芩甙用蒸馏水定容至30 mL，115℃下灭菌10 min后放入冰箱内保存备用。

2.3 培养基的制备及抑菌活性的测定

固体培养基的制备：烧杯内加适量蒸馏水后，依次加入牛肉浸膏5 g、蛋白胨10 g、琼脂2%、氯化钠5 g，然后再次加入蒸馏水至1000 mL；继而加入10%氢氧化钠溶液将pH值调节至7.2～7.4，115℃下高压灭菌20 min后备用。液体培养基的制备：在固体培养基制备过程中去掉琼脂，其他方法不变。

菌落的培养：将菌种分别接种于8 mL液体培养基中，37℃下培养18～20 h后，用生理盐水校正菌液浓度至1×105～1×106CFU／mL。

滤纸片平板扩散法检测抑菌活性：将定性滤纸裁剪成直径为5 mm的圆片并高压灭菌、100℃烘干后，置于黄芩甙药液中浸泡60 min，继而烘干备用；将固体培养基置于直径为9 cm的培养皿内，吸取0.1 mL菌液均匀涂布于培养基表面；将滤纸片贴在培养基表面后，置于37℃中培养24 h，测定抑菌圈直径。实验重复3次，取平均值。

试管稀释法检测最小抑菌浓度：取黄芩甙，配制100 mg／mL原液；取10支试管编号后每支加入2 mL液体培养基，并于1号试管内加入2 mL黄芩甙原液混匀后取出2 mL混合液加入2号试管内，再将2号试管内液体混匀后取出2 mL混合液加入3号试管内……直至10号试管内加入2 mL 9号试管混合液，配制成浓度依次为 50.00 mg／mL、 25.00 mg／mL、12.50 mg／mL、 6.25 mg／mL、 3.13 mg／mL、 1.56 mg／mL、0.78 mg／mL、 0.39 mg／mL、 0.20 mg／mL、 0.10 mg／mL的黄芩甙液体培养基；然后，每支试管内加入0.1 mL菌液，37℃下培养20～24 h，观察各试管内药液变化情况，若药液澄清则为有抑菌作用，若药液混浊则为无抑菌作用。

3 结果

3.1 不同提取方法提取黄芩甙含量对比

加碱温浸法提取黄芩甙含量最高，温浸法提取黄芩甙含量最低 （表1）。

表1 不同提取方法提取黄芩甙含量对比Table 1 Comparison of baicalin content extracted by different extraction methods

3.2 黄芩甙对不同菌群抑菌活性及最小抑菌浓度对比

黄芩甙对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌抑菌作用相对较强，对沙门氏杆菌抑菌作用相对较弱 （表2）。

4 讨论

《伤寒论》 《温病条辨》等中医著作中的众多描述与现代感染性疾病十分相似，并且记载了大量方药，且众多方药至今仍广为应用，与现代医学研究显示的由于中药的特殊性，其治疗效果受菌株耐药性的影响较小不谋而合。因此，研发抗菌中药对解决耐药菌株的产生和抗生素短缺等问题具有重要意义［7］。

目前，国内外众多研究学者对大量中草药进行了抑菌作用研究，如陈星灿等［8］筛选出五倍子、丁香等中药对福氏志贺氏菌、沙门氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等致病菌均有较强的抑制和杀灭作用。笔者鉴于部分研究显示，黄芩作为我国传统中药，其有效成分也对多种细菌表现出抑制作用，遂于本研究中对不同提取方法提取其有效成分黄芩甙的含量进行了测定，并对其抑菌活性和最小抑菌浓度进行了对比分析。结果显示，黄芩甙提取率由高到低的方法依次为加碱温浸法、醇提法、超声波法、煎煮法、温浸法，考虑可能与黄酮类物质多具有酚羟基，易溶于碱；黄芩甙具有脂溶性，易溶于醇；超声的空化效应具有粉碎、搅拌等特殊作用，利于黄芩甙与水相互渗透、溶解有关［9-11］。且黄芩甙对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌抑菌作用相对较强，对沙门氏杆菌抑菌作用相对较弱，具体作用机制有待进一步深入研究探讨。

表2 黄芩甙对不同菌群抑菌活性及最小抑菌浓度对比Table 2 Comparison of bacteriostatic activity and minimum inhibitory concentration of baicalin against different floras

综上所述，加碱温浸法是黄芩甙的最佳提取方法，黄芩甙对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌抑菌作用相对较强，对沙门氏杆菌抑菌作用相对较弱，具体作用机制有待进一步深入研究探讨。另外，值得注意的是，微生物感染性疾病的发生与治疗应为微生物、机体、药物三者之间相互作用的辨证关系，而目前的研究多为药物与微生物之间的关系，尚缺乏感染性疾病整体病理过程的研究，未能阐释中药标本兼治的功效及优势，有待进一步完善［12］；中药的应用多为复方制剂，而研究多只涉及单味药物，药物配伍后的协同及拮抗作用未能体现，有待进一步加强［13］。