不同产地何首乌HPLC指纹图谱研究

简丽莹

【摘  要】目的：用高效液相色谱法建立何首乌的指纹图谱，为何首乌的生产提供质量控制方法。方法：采用高效液相色谱法分析，Water X-Terra色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流动相：乙腈-0.1 %磷酸水溶液梯度洗脱，流速为1 ml/min，柱温：25 ℃，检测波长：265 nm。分析了十批不同产地何首乌指纹图谱，得出何首乌药材的指纹图谱共有模式。结果：在选定的色谱条件下通过相似度分析确定13个色谱峰构成生首乌药材指纹图谱的特征峰。结论：采用HPLC方法所建立的指纹图谱具有稳定性、重复性好的特点，可以用于何首乌药材的鉴别和质量控制。

【关键词】何首乌;HPLC;特征图谱

何首乌来源于蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥块根，具有解毒、消痈、截疟、润肠通便功效[1]。现代研究表明，何首乌主要含有的二苯乙烯苷类和蒽醌类成分，其中二苯乙烯苷具有降低胆固醇[2]、抗衰老[3-4]、提高免疫功能[5]、防治动脉硬化及保护肝脏等作用[6]，而蒽醌类成分具有润肠通便，抗菌消炎的功效[7]。

中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的色谱鉴定手段，可以借以鉴别真伪、评价原料药材、半成品和成品质量均一性和稳定性。为了更好的建立何首乌的质量控制方法，本实验拟通过十批不同产地何首乌指纹图谱，得出何首乌药材的指纹图谱共有模式。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A高效液相色谱仪，SPD-M10Avp二极管阵列检测器（日本岛津），LC Solution 色谱工作站（日本岛津）;sartorius电子分析天平。

1.2 试剂与药材

2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品 （以下简称二苯乙烯苷，， 批号： 201005）;大黄素对照品（批号： 110756- 200110）;大黄素甲醚对照品（批号： 110758-200610）均购于中国药品生物制品检定所，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。10批不同产地何首乌样品，详见表1，经鉴定为蓼科植物何首乌的干燥块根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Water X-Terra色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 m）;流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）;梯度洗脱：0 ～ 5 min，5% A;5 ～10 min，5% A～15% A;10 min ～ 30 min，15% A ～ 30% A;30 min ～ 60 min，30% A ～ 90% A。流速为1 ml/min，柱温：25 ℃;检测波长：265 nm。进样量10 L。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

称取二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚对照品适量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度。摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备

取何首乌药材粉末约0.5 g， 精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25 ml，称定重量，超声提取30 min，取出，放凉，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 m微孔滤膜，备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取同一份供试品溶液，按“2.1”项下条件重复进样 5 次，测得的指纹图谱与其所得共有模式图谱的相关系数均大于0.95，其共有峰的保留时间的 RSD 和峰面积的 RSD 均小于3 %，符合指纹图谱技术的要求。

2.3.2 重复性试验

精密称取 6 份同一批药材粉末，按“2.2.2”项的方法平行制得 6 份供试品溶液，同法进行检测。6 份供试品溶液所测色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱的均值相关系数（中位数）均大于 0.95，其共有峰的保留时间的RSD和峰面积的RSD均小于3 %，符合指纹图谱的技术要求。

2.3.3 稳定性试验

取同一份供试品溶液，按“2.1”项下条件于 0，3，6，9，18，24 h 进样检测，测得的指纹图谱与其所得共有模式图谱的相关系数均大于 0.95，各色谱峰峰面积RSD和保留时间RSD 均小于3 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4 样品测定

分别吸取上述供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。采用MATLA相似度评价软件对各样品色谱图的原始数据文件进行分析，以10批样品生成的对照图谱（中位数法）作为对照模版，计算各色谱图的整体相似度，结果见表2。从表可以看出各批何首乌药材质量相对稳定。

2.5 指纹图谱的建立和辨认

对样品的供试品溶液进行HPLC-DAD检测，得到不同批次何首乌HPLC指纹图谱（见图1），对何首乌HPLC色谱图进行共有峰识别，确定有13个共有峰（见图2），构建了何首乌药材的HPLC色谱图的指纹特征，作为何首乌鉴别的依据，其中4号峰为二苯乙烯苷，11号峰为大黄素，13号峰为大黄素甲醚，以二苯乙烯苷为对照，得出13个共有峰相对保留时间重现性较好，RSD为0.03 %～1.0 %;相对峰面积差异较大，其RSD为38.22 %～99.82 %。表明不同产地何首乌药材其组成成分基本上一致，但各峰的峰面积有差异，表明各成分含量存在差异。

3 讨论

3.1 提取溶剂的考察

分别用95 %乙醇、75 %乙醇、50 %乙醇、95 %甲醇、75 %甲醇、50 %甲醇6种溶剂各25 mL提取，结果表明95 %甲醇提取出峰最多，指示95 %的甲醇提取出的何首乌化学成分更全面。

3.2 提取方法的考察

分别采用了加热回流30 min提取、加热回流1 h提取、超声30 min提取、超声45 min提取。结果显示同一提取方法提取时间不同差别不大，其中超声提取比加热回流提取效果要好。所以选择30 min超声提取作为提取方法。

3.3 流动相的选择

甲醇-水，甲醇-0.1 %磷酸，乙腈-0.1 %磷酸等不同流动相组合考察结果显示，以乙腈-0.1 %磷酸为流动相，能较好地使样品中各色谱峰分离，且峰性对称。故选乙腈-0.1 %磷酸作为流动相系统。

3.4 检测波长的选择

对供试品溶液进行200 ～ 800 nm全波长扫描，其最佳吸收波长为265 nm，能给出最全、最佳的出峰信息，确定其为方法学考察波长。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：175- 177

[2] Yang PY，Almofti MR，Lu L，et a1.Reduction of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits and decrease of expressions of intracellular adhesion molecule-1 and vascular endothelial growth factor in foam cells by a water-soluble fraction of Polygonum muhiflorum [J].J Pharrnacol Sci，2005， 99 （3）：294-300.

[3] Xiao PG，Xing ST，Wang LW.Immunological aspects of Chinese medicinal plants as antiageing drugs [J].J Ethnopharmacol，1993，38（2-3）：167-175.

[4] 姚谦明，蒋宇刚，何启.何首乌对脑细胞Bcl一2基因表达的影响实验性研究[J].现代f临床医学生物工程学杂志，2002，8（2）：83-86.

[5] Ryu G，Ju JH，Park YJ，et a1.The radical scavenging effects of stilbene glucosides from Polygonum muhiflorum[J].Arch Pharm Res，2002，25（5）：636-639.

[6] 马宜明，杜贺庆.首乌神颗粒对小鼠学习记忆能力的影响[J].中药药理与f临床，2001，17（7）： 35-37.

[7] 苏玮，郭群.何首乌的现代药理研究概况[J].中草药，1997，28（2）：119-121.