浙江部分地区猪源链球菌的分离鉴定

曲业鹏，冯富，马有智

(浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058)

猪链球菌病是由多种致病性链球菌引起的人畜共患病，具有较高的流行性[1]。猪链球菌(Streptococcussuis，SS)是该病最主要的病原菌，马链球菌兽疫亚种、粪肠球菌、屎肠球菌、类猪链球菌等也易引发该病[2]。患猪链球菌病病猪临床表现主要有脑膜炎、关节炎和败血症等[3]。在我国，随着现代集约化猪场规模的不断扩大，猪链球菌病发病率持续升高，严重影响养殖业的发展[4]。

近年来，随着国内外学者对猪源链球菌生物学特性研究的不断深入和分子生物学的不断发展，PCR技术广泛应用于细菌的鉴定。本研究对2016—2018年浙江部分地区部分规模化猪场采集到的病料样品进行猪源链球菌的分离鉴定工作，旨在了解浙江地区链球菌的分布情况，从而为预防治疗猪链球菌病提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

病料来源自2016—2018年浙江杭州、金华、舟山、义乌和绍兴等地区规模化猪场的病死猪病料样品；脑心浸出液肉汤(BHI)和胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)购自北京陆桥公司；标准小牛血清购自上海联硕公司；绵羊血购自浙江金华利民试剂经营部；DL2000 DNA Marker与2×TaqPCR Mastermix购自TaKaRa公司；引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。

1.2 细菌分离培养

绵羊血平板制备：称取19 g TSA置于锥形瓶中，加入500 mL蒸馏水，水浴加热使TSA完全溶解，高压灭菌后将锥形瓶置于超净工作台冷却至55 ℃左右，加入25 mL绵羊血，期间不断振荡锥形瓶使绵羊血与TSA充分混匀，然后将其倒入一次性培养皿中(每个20 mL)，待培养基冷却凝固后放入4 ℃冰箱备用。

挑选病猪的肺脏、脾脏、肝脏、肾脏和淋巴结，用经酒精灯烧过的接种环蘸取脏器的病变部位，并画线接种到血平板上，37 ℃培养18～24 h。无菌挑取单菌落划线接种到血平板上纯化，37 ℃培养18～24 h。

通过革兰染色镜检与触酶试验，初步鉴定出疑似链球菌菌株。

1.3 DNA模板制备

分别挑取疑似链球菌菌株的单菌落接种到BHI液体培养基(含5%胎牛血清)中37 ℃过夜培养，取1 mL菌液于离心管中，12 000 r·min-1离心1 min，弃去上清液，加入100 μL双蒸水，置于沸水中11 min，再将其置于冰水混合物中6 min，再次离心，取上清液。

1.4 猪源链球菌检测

初步判定革兰染色阳性、触酶试验阴性的链状球菌为疑似链球菌，采用链球菌属16SrRNA引物对疑似链球菌菌株进行PCR检测。PCR反应体系(25 μL)包括：2×TaqPCR Mastermix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，用双蒸水调整终体积至25 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min； 94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 猪链球菌及其分型检测

采用猪链球菌16SrRNA引物对鉴定为链球菌的菌株进行PCR检测。PCR反应体系同1.4，退火温度为60 ℃，其他反应条件参照1.4，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

采用猪链球菌CPS1、CPS2、CPS5、CPS7、CPS8、CPS9和CPS29引物分别对猪链球菌进行PCR分型检测。PCR反应体系同1.4，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 非猪链球菌检测

使用VITEK 2 Compact全自动细菌分析系统对非猪链球菌进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 猪源链球菌分离培养

从2016—2018年浙江地区规模化猪场送检的病死猪病料中共分离到55株疑似猪源链球菌。通过染色镜检可发现疑似链球菌呈革兰氏阳性，菌体为球形或椭圆形，单在、成对或链状排列，在血平板上形成灰白色、光滑、圆形突起的小菌落，α溶血、β溶血和不溶血的现象均有出现。

2.2 猪源链球菌鉴定

55株疑似链球菌的PCR结果显示，有51株为猪源链球菌，均有207 bp目的条带。猪源链球菌中，有25株猪链球菌和26株非猪链球菌，检出率分别为49.02%(25/51)和50.98%(26/51)。

2.3 猪链球菌及其分型鉴定

25株猪链球菌PCR分型检测结果显示：1、2、7、8、9和29型SS分别在637、498、379、268、388、263 bp处有目的条带。结果见图1。其中2型菌株分离率最高，为48%(12/25)；8型菌株分离率次之，为16%(4/25)；9型菌株分离率为12%(3/25)；7型菌株分离率为8%(2/25)；1型和29型菌株分离率最低，均为4%(1/25)；未定型菌株占8%(2/25)。详见表2。

表2 猪链球菌分型鉴定

2.4 非猪链球菌鉴定

经VITEK微生物鉴定系统分析，26株非猪链球菌中，乳房链球菌、粪肠球菌、浅绿色气球菌和屎肠球菌各分离到3株，分离率均为11.54%(3/26)；毗邻链球菌分离率为7.69%(2/26)；停乳链球菌马样亚种、血链球菌、伪豕链球菌、猪肠链球菌、盲肠肠球菌、乳酸片球菌、耳炎差异球菌各分离到1株，分离率均为3.85%(1/26)；未确定到种的链球菌有5株，占19.23%(5/26)。详见表3。

表3 非猪链球菌分离鉴定结果

3 讨论

本研究对2016—2018年浙江地区规模化猪场病料样品进行了分离鉴定，结果表明，51株猪源链球菌中SS分离率为49.02%，SS中1、2、7和9型分离率分别为4%、48%、8%和12%。赵战勤等[4]对河南省及邻近省份在2011—2015年分离到的310株猪源链球菌进行鉴定，结果显示，SS有135株，分离率是43.55%，其中2型菌株的分离率达到53.3%，7型为10.4%，9型为10.4%，1型为1.5%，其他血清型占24.4%。Wei等[8]对中国16个省(市)患猪链球菌病的临床样本进行细菌分离鉴定，共得到719株链球菌，有407株SS，分离率是56.61%，其中2型分离率最高(43.2%)，7型和9型的分离率分别为3.7%和1.2%。本试验中，猪源链球菌的检出率与各型SS的检出率与上述报道基本一致。

本试验还分离到4株8型SS和1株29型SS，分离率分别为16%和4%，8型SS的分离率仅次于2型菌株，而陈雯雯等[7]对2017年广西地区SS分离菌株进行分型鉴定发现，5、8、29型SS的检出率分别为6.25%、31.25%和6.25%。尽管本试验中8型SS的检出率低于陈雯雯等报道的数据，但足以说明浙江地区存在8型SS，且有一定的流行趋势。

本次试验中，51株猪源链球菌中有26株非猪链球菌，分离率为50.98%，其中乳房链球菌、粪肠球菌、浅绿色气球菌和屎肠球菌均占11.54%，毗邻链球菌分离率为7.69%，停乳链球菌马样亚种、血链球菌、伪豕链球菌、猪肠链球菌和盲肠肠球菌等各占3.85%。贺名叶等[9]对湖南地区一些病死猪样本病原菌的鉴定结果显示：36株猪源链球菌中，除SS外另有12株种类不同的链球菌，分离率达到33.33%，其中浅绿气球菌占25.0%，马链球菌兽疫亚种、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌和停乳链球菌等各占8.33%。虽然本次试验中各链球菌属菌株的分离率与上述报道有差异，但也说明多种链球菌可引发猪链球菌病。肠球菌属原属于D群链球菌属成员，与链球菌属非常相似，分离鉴定时容易被误判为链球菌。