萝卜抽薹时间的QTLs定位及分析

曲丽君，张见，邢军，李欣屹

(天津天丰泽田生物科技有限公司，天津 300457)

抽薹是植物从叶丛中抽出花薹的现象，是植株由营养生长向生殖生长转化的关键时期，是植物在长期的进化过程中形成的特性[1-2]。由于植物物种及其产品器官的多样性，对于食用花茎、花蕾和角果的作物来说，适当促进抽薹开花是重要的。而对于以变态根和变态茎为产品器官的作物来说，抽薹会导致产品器官品质下降。萝卜是世界上重要的蔬菜作物，其产品器官为肉质根，不仅具有丰富的营养价值，而且具有较高的药用价值。萝卜先期抽薹指肉质根在完全膨大之前就已抽薹开花[3]。先期抽薹导致植株进入花芽分化状态，肉质根膨大基本停止，且随着花芽分化、抽薹和开花，肉质根由致密变为疏松，品质快速下降, 失去商品价值[4]。

关于抽薹性状的遗传规律在甘蓝、青花菜、大白菜等十字花科蔬菜中已取得重要进展。Kagawa[5]对大白菜的研究认为，早抽薹对晚抽薹为显性。Baggett等[6]研究青花菜和甘蓝的杂交组合，发现抽薹是数量性状遗传。张韬[7]认为，抽薹性状是由多基因控制的数量性状，但是早抽薹性状对晚抽薹性状并不是完全显性，易受环境的影响且遗传效力较低。一些控制甘蓝和大白菜抽薹性状的QTLs位点被挖掘。陈书霞等[8]利用F2群体构建了甘蓝类RAPD标记遗传图谱，并定位了同抽薹期相关的3个QTLs，分别位于第1、3和8号连锁群上。李梅[9]以结球甘蓝品种间杂交获得的F2群体作为构图群体，构建了甘蓝分子遗传图谱，并对结球甘蓝抽薹时间性状进行QTLs定位，最终获得1个与抽薹时间相关的QTL，可解释18.7%的表型变异。Kitamoto等[10]在经过春化的大白菜F2群体中将控制抽薹时间的QTLs定位于2、3和5号连锁群，其中位于2号连锁群的QTL对抽薹性状的贡献率达到46.0%，解释的表型变异最大。目前关于萝卜抽薹性状遗传规律的报道较少。Kaneko等[11]在萝卜异源染色单体中发现了1个早抽薹基因，它对于控制栽培种晚抽薹性状的几个基因均为显性。赵丽萍[4]利用主基因与多基因混合遗传模型联合分析方法对萝卜抽薹性状进行遗传分析，发现萝卜抽薹性状符合两对主基因+多基因遗传模型。这与其他十字花科蔬菜抽薹性状的遗传规律基本一致。

本研究中以早抽薹材料YS105和晚抽薹材料ZP85为亲本构建F2群体，同时借助SSR多态性标记构建的萝卜分子遗传图谱，进行萝卜抽薹时间的QTLs定位及分析，可为培育耐抽薹萝卜新品种及分子辅助育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以萝卜野生材料YS105为母本，栽培型材料ZP85为父本配制F1，F1严格自交获得F2群体。其中YS105为早抽薹材料，ZP85为晚抽薹材料。F2群体大小为342株。采取常规方法进行栽培管理。

1.2 抽薹性状调查及分级

自播种至花薹伸长至3～5 cm所需的天数作为抽薹时间。对亲本、F1和F2群体分单株进行连续调查并记录抽薹时间，直至栽培型材料ZP85肉质根成熟终止调查(播种后75 d)。根据各单株抽薹所需天数参照以下标准对其抽薹性进行分级：1级，抽薹天数≤45 d；2级，45 d<抽薹天数≤55 d；3级，55 d<抽薹天数≤65 d；4级，65 d<抽薹天数≤75 d；5级，抽薹天数>75 d。

1.3 DNA提取和分子标记

DNA的提取采用改良的CTAB法[12]。其中亲本和F1的DNA用于多态性SSR标记筛选，F2群体的DNA用于构建遗传图谱和QTL定位。

本文所用的SSR分子标记来源于萝卜基因组序列，根据萝卜EST序列设计的SSR引物[13]以及参照 Hashida 等[14]。PCR反应体系15 μL：2 μL DNA(40 ng·μL-1)，正向、反向引物(10 ng·μL-1)各0.25 μL，Taq酶 0.2 μL(2.5 U·μL-1)，dNTP 0.2 μL，Mg2+1.2 μL(25 mmol·L-1)，10×Taqbuffer 1.5 μL，ddH2O 9.4 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃保温8 min。扩增产物用8.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶，160 V恒功率电泳分离1 h，银染显色后在胶片观察灯下进行带型统计分析。SSR引物序列由上海生工生物技术公司合成。

1.4 遗传图谱的构建

利用亲本筛选多态性SSR分子标记对F2群体DNA进行分析。按照JoinMap 4.0软件[15]要求的方法统计条带：与父本YS105一致的带型记为a，与母本ZP85一致的带型记为b，杂合的带型记为h，未扩增出的或模糊不清的带型记为u。采用JoinMap 4.0软件作图，利用Kosambi作图将重组交换率转化为centi-Morgans (cM)[16]。

1.5 QTLs定位

利用MapQTL4.0软件[17]进行QTLs分析，首先利用置换测验1 000 次重复，根据“Permutation test”进行全基因组扫描，估算基因组范围内α=0.05水平上的LOD阈值。然后，利用区间作图法(interval mapping，IM)进行QTL分析，得到大于LOD阈值的QTL位点。对于IM分析得到的QTL，将最高LOD 值所在位置的标记或与其紧密连锁的标记作为协同因子，再对IM检测到的QTL进行多座位QTL模型(MQM)检测，作为最终的定位结果。以连锁群上LOD值最高的位置作为QTL的位置，同时分析每个QTL对萝卜抽薹性状的遗传参数和贡献率。QTL的命名规则如下：斜体字母“q”+性状的英文缩写+连锁群号+QTL编号[18]。如qbt-1-1即表示位于第1连锁群上第一个与抽薹时间(bolting time，bt) 相关的QTL。

1.6 数据统计及分析

利用 SPSS13.0 统计软件对双亲、F1及F2群体各单株的抽薹级数的调查结果进行统计分析并获得其表型变异及分布。

2 结果与分析

2.1 萝卜抽薹时间的表型变异

通过对植株抽薹时间的数据进行分析，发现母本YS105的平均抽薹时间为42 d，抽薹分级为1级，而父本ZP85在调查结束时(75 d)均没有植株发生抽薹，抽薹分级为5级。F1的平均抽薹时间为68 d，抽薹分级为4级，介于双亲之间。F2群体在调查结束时有119株仍没有发生抽薹，抽薹分级为5级，其他224株植株的抽薹时间变化幅度为32～75 d, 抽薹分级为1～4级(图1)。由此可见，萝卜抽薹时间性状在F2群体中的分布基本介于双亲之间，少部分植株在该性状中出现了超亲分离现象。

图1 萝卜F2群体抽薹时间分级的分布

2.2 SSR 遗传图谱构建

利用亲本和F1筛选到的114对多态性SSR标记对包含342个单株的F2群体进行鉴定。利用JoinMap 4.0[17]建立了包含9个连锁群的萝卜遗传图谱。该图谱覆盖基因组长度894.9 cM，平均标记间距为7.85 cM。连锁群的长度在50.8～155.4 cM。每个连锁群的标记数在6～20，其中LG1和LG4包含的标记数最多，为20个，LG5和LG9含有的标记数最少，仅有5个(图2)。

图2 萝卜抽薹时间遗传图谱及QTL定位

2.3 抽薹时间性状的QTLs定位

经“Permutation test”对全基因组扫描，估算“Rel.cum.count”为0.950 0时的Interval值为3.3，即设定当LOD值≥3.3时存在QTL。利用区间作图法并结合多座位QTL模型(MQM)检测，共检测到4个与萝卜抽薹时间相关的QTLs，分布于LG 5、LG 6、LG 8和LG 9上，分别命名为qbt-5-1、qbt-6-1、qbt-8-1和qbt-9-1 (图2、表1)。LOD值介于10.18～18.11，可解释8.4%～21.6%的表型变异率。

qbt-5-1的LOD值为10.18，介于标记RSS2108～RS5-3，贡献率为8.4%，加性效应为0.47，显性效应为0.20；qbt-6-1位于89_21540～89_21637，其LOD值为18.11，可解释14.7%的表性变异率，其加性效应为0.67，显性效应为-0.48；qbt-8-1介于41_14295～RS8-2，LOD值为16.69，可解释21.6%的表型变异率，该位点的加性效应为0.81，显性效应为0.06；qbt-9-1位于标记9ssr-10～9ssr-14，LOD值为11.57，贡献率为10.7%，加性效应为0.57，显性效应为0.13。

表1 萝卜抽薹时间QTLs定位及效应分析

3 讨论

萝卜抽薹性状为主基因和多基因控制的数量性状，易受环境条件影响，人为难以控制，且早抽薹对晚抽薹为不完全显性，因此，给选育耐抽薹品种及新种质资源开发带来较大困难[4,11]。分子图谱构建及QTLs定位可加速分子标记辅助育种的进程。本研究利用 F2群体对控制萝卜抽薹时间性状的QTLs进行定位及效应分析，最终得到与萝卜抽薹时间相关的4个QTLs位点(qbt-5-1、qbt-6-1、qbt-8-1和qbt-9-1)，分别位于萝卜第5、6、8和9连锁群上。它们的遗传贡献率分别为8.4%、14.7%、21.6%和10.7%，加性效应分别为0.47、0.67、0.81和0.57，显性效应分别为0.20、-0.48、0.06和0.13。这4个位点均为增效位点，可在低世代育种中快速选择纯合的优良性状。qbt-8-1贡献率达到21.6%，可能是控制萝卜抽薹时间的主效位点。

一些与抽薹性状相关的连锁标记的开发利用可大大加速耐抽薹品种的改良进程。Ajisaka等[19]利用BSA策略获得了一个与大白菜极晚抽薹性状紧密连锁的RAPD标记RA1255C，并成功转化为共显性RFLP标记，该QTL可解释77%的表型变异，为晚抽薹的分子标记辅助选择奠定了重要基础。目前对萝卜抽薹分子标记的研究还相对较少，存在遗传距离较大，尚不能较好地用于分子标记辅助育种的问题。赵丽萍[4]采用BSA与GRA策略，对抽薹性状进行多种遗传标记分析，获得可能与抽薹性主效位点紧密连锁的8个标记。徐文玲等[20]利用AFLP分子标记技术，结合BSA法，获得2个与萝卜耐抽薹基因连锁的标记，其遗传距离分别为14.6和9.1 cM。在本文中，我们将3个QTLs位点(qbt-5-1、qbt-6-1和qbt-9-1)的遗传距离控制在11.1 cM以内，下一步将继续在该区域附近设计引物进行加密，将萝卜抽薹性的基因控制在更小的距离范围内，力求获得与萝卜抽薹性更为连锁的分子标记，用于萝卜耐抽薹品种选育过程。