5株绿僵菌对橙带蓝尺蛾幼虫致病力比较

何学友，蔡守平，郑 宏，曾丽琼，陈文玉，林曦碧，詹祖仁

(1.福建省林业科学研究院、国家林业局南方山地用材林培育重点实验室，福建 福州 350012；2.龙岩市新罗区森林病虫害防治检疫站，福建 龙岩 364000； 3.泉州森林公园管理处，福建 泉州 362000； 4.明溪县森林病虫害防治检疫站，福建 明溪 365200；5.尤溪县森林病虫害防治检疫站，福建 尤溪 365100)

罗汉松(Podocarpusmacrophyllus)和竹柏(Podocarpusnagi)是我国园林绿化、庭园景观的重要树种，尤其是罗汉松经济价值大，种植数量多，我国每年均要从境外大量引种。橙带蓝尺蛾(MilioniabasalisWalker)属鳞翅目(Lepidoptera)尺蛾科(Geometridae)蓝尺蛾属 (MilioniaWalker)，是近年来在我国南方地区罗汉松和竹柏上发生的一种重要食叶害虫[1-2]，发生严重时，将寄主植物的叶片取食殆尽，只剩光秃的枝干，我国广西、广东、海南、台湾等地区以及国外的日本有发生和危害报道[3]。近年来，福建省各地也陆续发现该虫的危害，尤其在漳州、龙岩、泉州、三明、福州等地苗圃的罗汉松、竹柏发生十分严重，株虫口密度高达数百头，甚至上千头，造成较大损失。王缉健等[2]首次报道了该虫在广西危害竹柏的生物学特性，林伟等[1]报道了该虫在广东的发生，记述了该虫的形态学并提出防控建议，橙带蓝尺蛾存在明显的扩散蔓延风险。目前，该虫的防治多以暴发时喷施化学农药为主，尚未见其生物防治的报道。因此，探寻该虫的有效防治方法，尤其是生物防治显得十分必要。本文在比较不同金龟子绿僵菌菌株的菌落生长速度、产孢量的基础上，测定其对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力，旨在筛选出优良菌株，为橙带蓝尺蛾的防治提供生物防治资源。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

致病力测定使用的菌株为金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)(以下简称绿僵菌)，菌株具体信息见表1。将各菌株斜面上孢子转接到PDA平板培养基上，置于(25±1) ℃的恒温培养箱中培养10～15 d，充分产孢后收集孢子用于接种试验。

表1 供试金龟子绿僵菌菌株寄主与地理来源

1.2 菌株菌落生长速度及产孢量

菌株菌落生长速度和产孢量测定参考蔡守平[4]方法，每5 d采用十字交叉法测定1次菌落直径，产孢量测定采用打孔器取菌碟法。每个菌株做3个重复，每个重复产孢量测定时均取3个菌碟，计数方法采用血球计数板法。

1.3 绿僵菌对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力

1.3.1 试虫饲养 试虫为橙带蓝尺蛾幼虫，2019年5月12日采集于尤溪县罗汉松苗圃，该苗圃罗汉松被橙带蓝尺蛾严重危害。幼虫采集后即带回实验室，置于养虫笼中，以新鲜罗汉松叶饲养。1 d后挑选活动正常、3～4龄的幼虫放置于昆虫饲养盒中，每饲养盒放置15头，用于致病力测定。

1.3.2 致病力测定 致病力测定参考何学友等[5]方法，将各绿僵菌菌株的孢子使用0.03%的吐温-80溶液配制成孢子悬浮液，含量为107孢子·mL-1，使用喷雾法接种，即将配制好的孢悬液均匀喷在幼虫体表，对照用无菌水进行喷雾。每个菌株接种15头幼虫为1个重复，设置4个重复，即每菌株共接种60头试虫。处理完毕待虫体稍干后，以新鲜罗汉松枝叶进行饲养。接种后每天观察试虫的死亡情况，每2 d更换1次饲养枝叶，以轻触试虫虫体无任何反应为死亡标准，死亡后的试虫及时移出养虫盒，置于灭过菌的培养皿进行保湿培养，观察虫体是否有菌丝长出及产孢，确定是否被绿僵菌感染。

1.4 数据处理

数据统计分析使用DPS数据处理系统软件处理，根据观察结果统计接种后15 d的幼虫死亡率和感染率。采用DPS自带的死亡率—时间机率值分析模块计算不同绿僵菌对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力，即以时间(d)的对数值为x，将死亡率转换为机率值，并以机率值为y，模拟出致病力回归方程，计算致死中时(LT50)，各菌株之间的LT50差异采用比例测定方法来检验[6]。

2 结果与分析

2.1 不同绿僵菌菌株的菌落生长速度及产孢量

不同来源的绿僵菌菌株菌落生长速度和产孢量间存在显著的差异(表2)。菌落生长速度与产孢量之间并没有显著的相关性，主要是由菌株自身特性决定。如MaFZ-16菌株，虽然菌落生长速度较快，15 d菌落直径可达5.9 cm，但菌落以菌丝生长为主，产孢量最低，仅0.76×108孢子·cm-2；而MaXJ-04菌株15 d菌落直径为6.1 cm，但产孢量高达1.17×108孢子·cm-2。菌落生长速度最快的为MaZPTR-01菌株，培养15 d的菌落直径达6.5 cm；其次为MaFZ-13菌株，为6.2 cm。从产孢量看，最高的是MaFZ-13菌株，MaZPTR-01菌株次之，分别为1.33×108孢子·cm-2、1.28×108孢子·cm-2(两者差异不显著)，第三为MaXJ-04菌株。

表2 不同绿僵菌菌株的菌落生长速度及产孢量

*：表中数据为平均值±标准差；同列中不同小写字母为差异显著(P<0.05)；下同。

2.2 绿僵菌对橙带蓝尺蛾幼虫的致死情况

幼虫接种孢子悬浮液后1～2 d，大部分幼虫未表现出感病症状；2～3 d后，部分幼虫出现不活跃、取食减少的情况，少量幼虫开始死亡。接种MaFZ-13和MaXJ-04菌株的幼虫死亡速度较快，3～7 d出现死亡高峰，60%以上的幼虫在这个时段死亡，5～10 d为死亡高峰。此后也有部分幼虫逐渐死亡，但死亡速度明显放缓。部分幼虫死亡后虫体逐渐变僵硬，不发臭，保湿培养1～2 d后有白色菌丝长出体表，逐渐长满全身，随后出现墨绿或深绿色孢子，后期整个虫体均布满粉末状的分生孢子，从死亡到完全产孢大约需要7 d(图1)，但也有部分幼虫死亡后发臭腐烂。

图1 橙带蓝尺蛾幼虫及其被绿僵菌感染状

橙带蓝尺蛾幼虫接种不同绿僵菌菌株后死亡情况见图2，幼虫死亡率随时间的增加而逐渐提高，但不同菌株对幼虫的致死速度间存在显著差异。接种MaFZ-13和MaXJ-04菌株幼虫死亡率较高，这2个菌株接种9 d后，幼虫死亡率达到或超过80%，而其它菌株则低于70%。接种15 d后，MaFZ-13和MaXJ-04菌株对幼虫的致死率分别达到96.7%和95.0%，其它菌株均低于90%，最低的是MaQL-02菌株，为71.7%。试验记录期为15 d，此阶段未死亡的幼虫，后续也逐渐死亡，但耗时较长，只有接种MaQL-02和MaFZ-16菌株的出现了少数化蛹的情况，其他处理组均没有幼虫化蛹。对照组幼虫死亡率为10%，未死亡的幼虫正常化蛹。

图2 橙带蓝尺蛾幼虫接种不同绿僵菌菌株后的累计死亡率

2.3 不同绿僵菌菌株对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力

不同绿僵菌菌株对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力分析结果见表3。通过死亡机率值—时间模型进行不同菌株的致病力回归方程模拟，经检验，各方程拟合程度均达到显著水平，表明时间与累计死亡率显著相关，但不同菌株对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力存在显著差异。从校正死亡率和僵虫率方面来看，接种MaFZ-13和MaXJ-04菌株的较高，15 d幼虫校正死亡率分别达到96.3%和94.4%，僵虫率分别为75%和71.7%；而接种其它菌株的校正死亡率低于90%，最低的是MaQL-02菌株，仅为68.5%，僵虫率仅为41.7%。同时，从不同菌株的致死中时(LT50)来看，MaFZ-13菌株最短，MaXJ-04菌株次之，分别为5.01 d和5.48 d，显著短于其它菌株。

表3 不同绿僵菌菌株对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力

3 结论与讨论

橙带蓝尺蛾目前多以化学药剂进行应急防治为主，探寻该虫的生物防治资源尚未见报道。本研究通过测定比较了5株来源不同的绿僵菌菌株对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力，筛选出对橙带蓝尺蛾幼虫致死率高、致死速度快和感染率好的MaFZ-13和MaXJ-04菌株，且这2个菌株生长速度快，产孢量高，可作为该虫优良的生物防治资源加以利用，林间相关应用技术有待进一步深入研究。

绿僵菌、白僵菌等虫生真菌致病机理一般是通过体表侵入害虫体内，并在害虫体内不断增殖，通过消耗营养、机械穿透、产生毒素等作用使害虫致死，通常致死害虫过程需要3～6 d。本研究中橙带蓝尺蛾幼虫接种致病力高的绿僵菌菌株后死亡高峰出现在3～7 d，符合绿僵菌的致病过程[7-8]。但在防治实践中，绿僵菌的防治效果还受到林间环境、寄主免疫抵御等多种因素影响，导致应用时防效往往较慢，甚至需要10 d以上，相对化学农药来说，较慢的致死效应会使绿僵菌在橙带蓝尺蛾这种爆发性的害虫防治中受到一定限制。为了解决防治时效慢的问题，很多学者尝试将真菌杀虫剂与低剂量农药复配，以达到协同增效的作用[9]，提高防治效果，如低剂量印楝素与杀蝗绿僵菌混用比单独施用绿僵菌相对亚洲小车蝗的LT50缩短了3.17 d[10]；绿僵菌与亚致死剂量敌杀死混用对马尾松毛虫的LT50可提前7 d[11]；绿僵菌与亚致死剂量的杀虫单混合使用后，对椰心叶甲的致死率显著提高，LT50缩短了2.1 d[12]。其机理是农药通过作用于昆虫的外骨骼，使真菌更容易侵入害虫虫体，这样既可以达到快速致死的目的又可以提高真菌的感染率，并可大幅减少农药使用量，减少农药对生态环境破坏，对避免害虫产生抗性方面有积极的作用[13-14]。因此，在应用绿僵菌生物防治橙带蓝尺蛾过程中，采用菌药复配策略值得今后深入开展研究。