OTUD5在宫颈癌中的表达及对Hela细胞增殖的影响

杨 静，霍玉青

(滨州医学院附属医院肿瘤科，山东 滨州 256600)

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，严重威胁着妇女的健康。在常见恶性肿瘤中宫颈癌的发病率位居第三位，在妇科恶性肿瘤中其死亡率位居第四位。据全球范围统计，每年约有47.1万新发病例，21.5万死亡病例。我国每十万妇女中有12.96人患宫颈癌，3.28人死于宫颈癌[1]。80%的宫颈癌发生在发展中国家，且发病年龄年轻化给妇女健康带来严重影响。

蛋白质泛素化是一个可逆的过程。一些蛋白质家族具有去泛素化的活性，其中包括卵巢肿瘤蛋白酶(OTU)家族、泛素特异蛋白酶(USP)家族和泛素C端水解酶(UCH)家族等[2]。OTUD5(OTU domain-containing protein 5 )属于含有OTU结构域的半胱氨酸蛋白酶超家族。OUT结构域能介导去泛素化酶活性，OTUD5能通过去除的K63多聚泛素链泛素化抑制I型干扰素的产生[3]。但目前其在宫颈癌中的表达及意义尚不明确。

1 资料与方法

1.1临床标本免疫组化检测及结果判定：收集60例行根治性手术治疗的宫颈癌患者病理标本，所有标本均经病理学证实。兔抗人OTUD5单克隆抗体购于Novus公司。过氧化酶标记的链酶卵白素(streptavidin-perosidase，SP)免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德公司。采用半定量积分法判断阳性结果，以出现棕色颗粒作为阳性标准。将“-”定义为阴性表达，“+”及“++”定义为低表达，“+++”定义为高表达。低表达和高表达为阳性表达。

1.2细胞和试剂：使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)从组织中分离总RNA。 使用转录物第一链cDNA合成试剂盒(Roche，Mannheim，Germany)合成cDNA。 实时PCR由Faststart Universal SYBR Green Master(Roche)进行。OTUD5正向物：GAAGTAGATGTGGCACCATT，反向引物：CATTCCCACCACAGAAGACC。

1.3细胞和试剂：宫颈癌Hela细胞系购自中国科学院上海细胞库，使用低糖DMEM加10%胎牛血清( FBS)进行细胞培养、传代、冻存等，用于实验的细胞无支原体污染，状态良好。OTUD5过表达质粒购自山东维珍生物公司。

1.4细胞培养和实验分组：细胞经RIPA裂解细胞后,4 ℃低温离心机中离心(12 000×g，5 min)，提取总蛋白，BCA法蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。制备相应浓度SD-PAGE凝胶，将蛋白加入凝胶孔中(相应加入Maker)后进行电泳，转膜至PVDF膜上，洗涤后BSA封闭，先后加入一抗二抗孵育，加入发光液，曝光、洗片，扫描并分析。

1.5CCK-8细胞增殖实验：35 mm培养皿培养Hela细胞，待细胞融合度至80%，以每孔2 000个细胞均匀铺于96孔板，每组设6个复孔，分别培养0、24、48、72、96 h后，弃去96孔板内培养基，每孔加入100 μl用培养基稀释好的CCK-8溶液(1∶10)，培养箱内孵育1 h，使用多功能酶标仪检测450 nm处的吸光值( A)。计算各时间点A值变化倍数，用以表示细胞增殖倍数，增殖倍数= A ( x h) /A ( 0 h)，x = 0、24、48、72、96。

1.6Western blotting检测：Hela细胞弃培养基后用预冷的生理盐水冲洗，加入RIPA蛋白裂解液，离心20 min，取上清到EP管中，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。蛋白溶液使用SDS-PAGE电泳分离全蛋白样品，将蛋白转移至PVDF膜上，按说明书比例稀释一抗及内参GAPDH，最后充分洗膜完成后，进行定量分析，以光密度值(OD) 表示。

2 结果

2.1OTUD5在宫颈癌组织及癌旁组织的表达：全组患者病理标本经免疫组化检测，OTUD5阳性表达主要着色于细胞浆。在全组60例宫颈癌组织标本中，阴性表达20例，弱阳性17例，中度阳性14例，强阳性9例，高表达率为38.3%(23/60)；在癌旁组织中，阴性表达21例，弱阳性26例，中度阳性8例，强阳性5例，高表达率为21.7%(13/60)。两组之间行χ2检验，差异有统计学意义(χ2=3.968，P=0.046)。见表1。

表1 OTUD5在宫颈癌及癌旁组织中的表达[例(%)]

位置例数OTUD5表达高表达 低表达χ2值P值癌组织6023(38.33)37(61.67)3.9680.046癌旁组织6013(21.67)47(78.33)

2.2RT-PCR技术检测OTUD5在宫颈癌组织及癌旁组织的表达：为了明确宫颈癌及癌旁组织OTUD5 mRNA表达情况，我们选取10例新鲜手术切除标本为研究对象。分别提取RNA并进行qRT-PCR。结果如图1所示，癌组织中OTUD5 mRNA表达水平明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3OTUD5过表达Hela细胞系的建立：应用慢病毒包装技术构建过表达OTUD5的Hela细胞系。使用Western blot检测转染前后OTUD5蛋白水平的变化。结果如图2所示，pcDNA3.1转染后细胞内OTUD5蛋白相对表达水平为0.435±0.048，pcDNA3.1- OTUD5转染后细胞内OTUD5蛋白相对表达水平为0.224±0.139，两组间差异有统计学意义(t=-3.162，P=0.012)。

图1 OTUD5 mRNA表达在宫颈癌及癌旁组织的比较

图2 OTUD5过表达前后宫颈癌细胞系Hela中OTUD5蛋白的相对表达量

2.4OTUD5过表达对Hela细胞增殖和克隆能力的影响：为了明确OTUD5过表达后Hela细胞增殖有无改变，以转染pcDNA3.1空载体的细胞为对照组，以转染pcDNA3.1- OTUD5的细胞为实验组，分别培养48 h，应用CCK-8法检测0 h、12 h、24 h、36 h、72 h、5 d、7 d各样本吸光度值(OD 570 nm)。如图3A所示。两组间细胞增殖率在24 h后出现统计学差异(P<0.05)，持续至7 d。平板克隆实验显示，OTUD5过表达后Hela细胞的克隆增长能力明显增强(见图3B、C)，与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图3 A：OTUD5过表达后Hela细胞增殖能力比较；B,C：OTUD5过表达后Hela细胞平板克隆能力比较

3 讨论

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，其发病趋势有年轻化趋向，且近些年腺癌的类型明显增加，严重危害女性的健康。虽然宫颈癌发病的诸多诱因已得到证实，但其在基因水平的变化尚未完全明了。有研究表明，泛素化的发生在宫颈癌的发生和发展的过程中发挥着重要的作用，被证实参与了从正常细胞向癌细胞的转化、癌细胞的侵袭和转移的过程，对宫颈癌患者的预后产生重要的影响[4-7]。

泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式。尽管蛋白质的泛素化通常导致蛋白的降解，但蛋白质泛素化也能导致信号通路的活化或蛋白质的转运[8-10]。比如，赖氨酸48(K48)位点的多聚泛素化链能导致蛋白质的降解，而赖氨酸63(K63)位点的多聚泛素化链对于细胞内信号的转导和蛋白质的转运具有重要的意义。OTUD5属于含有OTU结构域的半胱氨酸蛋白酶超家族，OUT结构域能介导去泛素化酶活性[11]。2007年有报道OTUD5能通过去除TRAF3的K63多聚泛素链泛素化从而抑制I型干扰素的产生[12]。因此，合理猜测OTUD5可能通过去除Akt的K63位点多聚泛素化，减少Akt的细胞膜转移，降低其T308位点的磷酸化，并抑制Akt的活性，从而减少由于Akt高度活化导致的宫颈癌放疗耐受。本研究中我们发现OTUD5在宫颈癌组织中表达高于癌旁正常组织，进一步通过构建过表达OTUD5的细胞系发现，过表达OTUD5的Hela细胞系增殖及侵袭活性明显增强，从而说明上调OTUD5的表达可以促进宫颈癌Hela细胞的增殖及侵袭能力。

本研究虽然从RAN及蛋白水平发现了OTUD5在宫颈癌中的表达情况，但仍停留在现象层面，未能从分子水平对其作用机制进一步证实，且样本量相对较少，尚需进一步研究证实。