17β-雌二醇对肾缺血再灌注损伤后肾间质纤维化的影响

丁 宁，周奥飞，章林明，李 丽，王勤章，李应龙

(石河子大学第一附属医院，新疆 石河子 832000)

缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)损伤属于较为常见的临床损伤，而作为高灌注器官的肾脏，特别容易在I/R过程中受到损害。缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)是指机体通过灌注血液后，原本缺血的状态虽然得以改变，但是缺血组织并未恢复正常的代谢功能，反而因为缺血灌注而导致损伤加剧，出现水肿、充血、纤维化等病理改变[1]。此种损伤常出现于休克后复苏、肾部分切除术、肾积水、肾移植手术、肾脏动脉血管成形术、选择性尿路手术、肾肿瘤切除术等[2]。肾脏在缺血再灌注损伤过程中，肾小管上皮细胞是损伤最为严重的部位。近年来，许多文章表明，肾IRI晚期可发生肾脏纤维化[3-4]。目前常见的急慢性肾脏疾病晚期大都伴随着纤维化病变。IRI对肾脏远期损害显著，主要是对其功能的影响。如在肾移植术后，移植肾失去功能、肾脏纤维化以及急性或慢性排斥反应。所以改善IRI对肾移植后移植物远期影响的重要方式之一就是延缓或者减轻纤维化这一过程，在其他脏器移植手术后，减轻纤维化亦可增加移植物的存活率[5]。转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)在肾纤维化进程中起到重要作用，在纤维化形成、细胞增殖、凋亡、肥大过程中都有发挥作用[6]。TGF-β是一种分布十分广泛、可在机体内几乎所有细胞生成的一种具备多向调节能力的生长因子，并且有多达5种同分异构体，其中在人体中所占比例最高且活性最强的是TGF-β1[7]。肾间质纤维化的主要病理改变是正常组织被肾细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)所取代[8]，TGF-β1的过度表达可促进这一过程的发展。有实验证明，其通过增加肾小球系膜细胞和成纤维细胞等细胞外基质合成增多，从而促进纤维化的进展[9]。实验证明TGF-β1的过度表达可促进肾小球系膜细胞和近曲小管上皮细胞等细胞ECM的合成，进而促进肾纤维化[10]。在肾脏进行性纤维化过程中，TGF-β1是造成纤维化的关键中间产物，同时TGF-β1的表达水平可间接反映肾脏的纤维化[11]。

雌激素是一种生物效能非常广泛的类固醇激素，MARIC等提出其抗纤维化作用机制主要在于其参与胶原、系膜基质的合成与降解[12]。但是在肾小管上皮细胞间质病变过程中，对于此类固醇激素抑制纤维化的机制尚不明确。17-β雌二醇(E2)是雌激素的主要活性成分。本研究通过大鼠动物手术造模模拟体内缺血/再灌注模型，并通过雌激素干预，检测干预组与对照组之间的病理变化、纤维化水平和TGF-β1表达变化，以此探究雌激素对肾缺血再灌注损伤后纤维化过程中所发挥的作用机制。

1 资料与方法

1.1实验动物：选取32只雌性SD大鼠，体重250～300 g，周龄8～12周，分为4组，每组8只。动物房室内温度及湿度合适，提供标准饲料，进食水未干预，室内环境适合，正常饲养1周后进行实验。

1.2主要试剂与仪器：17β-雌二醇；Masson实验试剂；兔源多克隆TGF-β1抗体(Abcam公司)；β-actin 一抗、羊抗兔二抗(北京中杉金桥公司)

1.3方法

1.3.1动物模型制备：实验研究对象为32只雌性SD大鼠，根据已报道的雌激素干预研究动物模型进行造模[13]。实验前先对大鼠进行去卵巢处理，具体流程如下：首先麻醉大鼠，准备手术消毒、备皮、铺巾工作，以腹部正中为切入口，刀口从耻骨联合上方1 cm到剑突下方，将暴露后的双侧卵巢切除后，缝合伤口。手术后，喂养2周可正式开始研究实验。每组8只，共4组，分组如下：第一组为正常组(control组)，该组大鼠不采取任何措施；第二组为假手术组(Sham组)，对大鼠腹部注入戊巴比妥钠50 mg/kg进行麻醉，术区备皮、碘伏擦拭、铺盖无菌洞巾，以腹部正中作为切入口，刀口从耻骨联合上方1 cm到剑突下方，暴露双侧肾脏后，将右侧肾脏切除，不做夹闭左侧肾蒂，手术持续约45 min后关闭腹腔；第三组为缺血再灌注损伤组(L/R组)，对大鼠进行麻醉并剔除腹部毛发，用碘伏对腹部手术位置进行消毒处理，以腹部正中作为切入口，刀口从耻骨联合上方1 cm到剑突下方。与假手术组同方式处理右侧肾脏，但是左侧肾蒂采用无创动脉夹夹闭，观察大鼠肾脏颜色是否发生变化，当鲜红色转变为暗红色时说明缺血成功，反之则表明手术失败。45 min后，去除左侧肾蒂的无创动脉夹，恢复肾脏灌流；第四组为17β-雌二醇预处理干预组(E2+I/R组)，术前3 d连续给予17β-雌二醇100 μg/(kg·d)皮下注射，第4天进行手术，其余处理同I/R组。为模拟I/R组和E2+I/R组雌激素注射，用等量的生理盐水分别注入Control 组和 Sham 组大鼠腹腔内。所有大鼠继续饲养2周后，断颈处死后解剖剥离肾脏。

1.3.2苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色：剥离后的大鼠肾脏沿纵向切开，等量分成两部分，一部分储存于-80℃，另一部分浸泡在福尔马林中固定24 h后，使用石蜡包埋处理，切片，HE染色液进行染色，通过显微镜观察切片中组织病理形态的变化。将肾小管间质组织损伤程度用Paller法表示出来：使用光学显微镜，在200倍视野下，随机观察10个肾小管，对其进行评估，具体评分依据：肾小管管径增加、细胞形态改变计1分；刷状缘改变计1分，脱落计2分；管型计2分，肾小管管腔内有脱落坏死的细胞计1分。

1.3.3Masson染色：组织固定液处理后肾组织乙醇脱水，石蜡包埋，切片，将切片经马松染色处理，光镜下观察各组肾组织纤维化改变情况。

1.3.4Western blot 法检测肾组织TGF-β1蛋白表达水平：将肾脏组织放入液氮中研磨，并用含1%蛋白酶抑制剂的RIPA对研磨后的组织进行裂解，将组织总蛋白分离出来，采用BCA法进行蛋白定量并加入4xLoading Buffer，95℃加热10 min进行预变性，对所取样的蛋白进行电泳、转膜操作，再用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，经过TGF-β1及β-actin一抗孵育过夜(浓度为1∶1 000)，TBST洗三遍，室温孵育HRP连接二抗1 h(浓度1∶3 000)，使用化学发光法进行曝光、拍照，应用ImageJ分析条带灰度值。

1.4统计学处理：通过SPSS22.0软件来处理相关数据信息，用绘图来代表，运用One-way ANOVA进行统计，Turkey多重检验分析组间差异，P<0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1肾组织病理学检查及组织Paller评分：基于Paller法评分，Control组、Sham组：肾组织形态结构无明显变化；I/R组肾小球结构明显变化，出现萎缩，肾小管出现肿胀、坏死及细胞脱落，管腔大小明显改变、肾间质均出现了病理变化，Paller评分较Sham组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；E2+I/R组肾小球结构无明显改变，肾小管上皮细胞、肾间质、炎性细胞浸润较I/R组轻，Paller评分较I/R组低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。图A-c黑色箭头为较典型的肾小管病理变化。

2.2Masson染色后各组肾组织纤维化改变情况：细胞外胶原纤维呈蓝色，胞浆呈红色，胞核呈黑蓝色。观察可见Control组、Sham组大鼠肾小管上皮细胞均匀排布，肾小囊、小管基底膜肾小球系膜与血管周围蓝染区均较少；I/R组肾小管间质出现大量胶原堆积；E2+I/R组虽然有少量蓝色胶原堆积，但较I/R组少。见图2。

2.3Western blot 法检测TGF-β1蛋白表达：通过imageJ将TGF-β1与β-actin条带灰度值进行相对定量统计，I/R 组TGF-β1较Sham组要表达水平高;E2+I/R组的蛋白表达要比I/R组少，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

a. control组；b.sham组；c.I/R组；d.E2+I/R组

a.control组；b.sham组；c.I/R组；d.E2+I/R组

图3 各组大鼠肾组织TGF-β1蛋白表达量变化

3 讨论

肾脏作为机体血液高灌注器官之一，在很多疾病或术式中易受到缺血再灌注损伤，如肾移植、肾部分切除等。肾缺血再灌注损伤发生后，主要涉及肾小球和肾小管功能的损伤，近年许多研究已证明，缺血再灌注损伤后期可出现肾小管间质纤维化[15]。肾脏疾病如果不及早进行控制，发展到最后就会演变成肾间质纤维化，最终会造成肾衰竭。之所以会出现肾脏纤维化，是因为没有对慢性肾病重视起来并未控制其发展。在各种疾病不断发展后期常见病理变化为细胞外基质堆积(ECM)，健康细胞由新生的ECM充当，造成一系列难以逆转的肾脏疾病[16]。本课题以大鼠夹闭肾蒂45 min后恢复灌注来模拟缺血-再灌注损伤，可以反映出肾移植期间的缺血情况。根据HE及Masson染色结果，I/R组大鼠肾小管上皮细胞出现肿大、坏死、萎缩；间质也出现了纤维化，说明造模成功。

研究证实，TGF-β1信号转导通路是影响肾间质纤维化的主因素之一[17]。临床研究表明，肾小球出现硬化、间质纤维化与TGF-β1信号通路的激活密切相关[18]。TGF-β1一方面对系膜细胞、上皮细胞、成纤维细胞起调节作用，从而产生大量ECM堆积；另一方面它增加蛋白酶抑制因子的合成，使ECM无法降解。TGF-β1的过度表达就会造成肾小球与小管间质系列问题，最终使其向纤维化等方向演变。TGF-β1可参与许多与肾间质纤维化有关的反应，涵盖加速基质的合成、抑制基质的降解、上调整合素基质黏附分子的表达从而趋化成纤维细胞和单核细胞到达损伤部位。肾脏瘢痕出现期间，因TGF-β1导致细胞外基质越来越多，组织受到的侵害也越来越严重。研究显示，对TGF-β1的生物活性进行控制，可以有效减少细胞外基质成分，对纤维化的控制也有显著效果[19-20]。

之前的研究已经证实，人体纤维化疾病的发展因性别而有区别：女性比男性更抗纤维化[21]；与男性及绝经后妇女相比，绝经前妇女患严重肝纤维化的风险较低[22]。越来越多的证据表明，雌激素能抑制多个器官的细胞和纤维化的激活，包括肝脏、心肺和肾脏[23-24]。雌激素是一种具有广泛生物活性的类固醇激素，临床显示，雌激素对肾素-血管紧张素系统以及肾内、外血流动力学有一定的作用，从而调节肾小球功能，减轻灌注压力；对VEGF的表达有促进作用，增加系膜细胞的活性，使细胞外基质合成表达能力降低，同时对抗氧化剂与脂代谢等，具有调节功能，减轻肾功能受害程度[25]。雌激素可以缓解肾组织的损伤程度，使ECM成分尽可能控制在一定范围内，对肾间质纤维化起到控制作用；作用于TGF-β1可以改变其活性从而使其表达受限，可以一定程度上抑制上皮细胞向肌成纤维细胞转变，有效抑制ECM的合成，从而使病变肾组织ECM合成减少，降解增加，从而延缓肾间质纤维化的发展。

本次研究表明，雌激素会缓解缺血再灌注损伤大鼠肾间质纤维化，且减少TGF-β1的表达水平，由此推测雌激素可通过下调TGF-β1的表达来降低纤维化，但其详细的机制还需要更深一步研究。

随着泌尿外科术式不断进步与发展，传统根治性肾切除被保留肾单位手术所取代，随着肾移植手术的不断进步，肾缺血再灌注损伤所带来的问题就愈发明显。终末期肾病较常采用的治疗方法之一就是肾移植，但是移植过程中易出现缺血再灌注损伤。如何降低肾缺血再灌注损伤导致的移植物远期功能异常也成为肾移植领域研究热点之一。本试验为肾脏缺血再灌注损伤的防治提供依据，也为其他纤维化肾脏疾病的临床治疗提供新思路。