不同时长脱氢表雄酮诱导多囊卵巢综合征大鼠模型的比较

张 萍 ，王维斌 ，邵岩飞 ，陈锦明 ，俞 洁 ，3，4，高碧珍 ，3，4*

（1.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122；2.中医证研究福建省高校重点实验室，福建 福州 350122；3.福建省中医健康管理2011协同创新中心，福建 福州 350122；4.福建省中医健康状态辨识重点实验室，福建 福州350122）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是临床常见的生殖内分泌代谢性疾病，严重影响患者的生命质量、生育及长期健康［1］。目前PCOS以药物治疗为主，虽短期内可纠正其内分泌紊乱状态，恢复排卵，但一旦停用药物之后极易复发。其理想治疗药物的研究也成为当今的热门，而临床收集患者样本较为困难。因此，建立理想的PCOS动物模型对药物评价及后续研究具有重要意义。目前国内外诱导PCOS动物模型主要以雄激素造模法最为多见，张晓薇等［2-5］运用脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）复制 PCOS大鼠模型，此法是采用23日龄的SD大鼠，在其颈背部皮下注射DHEA 20 d。大鼠本身有较强的自愈能力，这对研究结果的准确性和科学性有较大的影响，为防止模型自愈而恢复排卵，诸多研究者在药物干预的同时每天持续注射 DHEA［6-8］。 而目前对于 20 d DHEA诱导的PCOS动物模型是否会恢复排卵以及是否持续造模效果更佳，尚无明确科学依据。在中药治疗PCOS模型大鼠的实验研究中，中药干预时间一般是 4周［9-10］，因此本研究以20 d及48 d为临界点，采用不同时长DHEA诱导PCOS大鼠模型，比较二者模型的特点，为选择合适的诱导时长提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 21日龄SPF级SD雌性大鼠28只，体质量50～60 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证编号：SCXK（沪）2017-0005。饲养于福建中医药大学实验动物研究中心SPF级屏障系统中，许可证编号：SYXK（闽）2014-0005，温度（20±2）℃，湿度40%～60%，12 h周期性光照环境，普通饲料喂养（各成分热量比例为：碳水化合物60%，蛋白质22%，脂肪10%，包括纤维素在内的其他成分8%）。除实验期外自由饮食、饮水。本研究所有相关动物实验操作均符合动物伦理学，审批号：2019福中医伦理字第（013）号。

1.2 实验试剂 注射用大豆油剂（源叶生物有限公司，批号：T15S9Z70260）；DHEA（麦克林公司，批号：C10098326）；大鼠睾酮（testosterone，T）ELISA 试剂盒、大鼠黄体生成素（luteinizing hormone，LH）ELISA试剂盒、大鼠卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）ELISA试剂盒（江苏酶免实业有限公司，批号：1901R、1901R、1901R）；HE 染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20180727）。

1.3 实验仪器 超低温冰箱（美国Ependorf公司）；包埋机、RM2245半自动切片机（德国徕卡公司）、Infinite M200 Pro多功能酶标仪（奥地利TECAN公司）；SIGMA冷冻高速离心机（3K30，德国sigma公司）；体式显微镜（TP630，苏州神鹰光学有限公司）。

2 实验方法

2.1 药物制备 临用前将DHEA溶于注射用大豆油剂中，配制30 mg／mL质量浓度的DHEA。

2.2 动物分组造模 21日龄SPF级SD雌性大鼠28只，适应性喂养2 d后，按体质量从大到小依次编号，采用随机数字表法分为正常组10只和造模组18只。正常组每日颈部皮下注射0.2 mL注射用大豆油剂，造模组同部位注射0.2 mL的DHEA，均连续注射20 d。第21天正常组和造膜组各取2只进行卵巢组织HE染色观察。造模组镜下可见卵巢呈多囊样变，无成熟卵泡，无卵母细胞及卵丘，卵巢颗粒细胞层多为1～3层，且排列稀疏，少见黄体，证明PCOS模型成功建立。随后将造模组分为模型组Ⅰ和模型组Ⅱ各8只。正常组、模型组Ⅰ每日皮下注射0.2 mL的注射用大豆油剂，模型组Ⅱ每日皮下注射DHEA，均连续注射28 d。每日早晨9：00进行1次阴道脱落细胞学观察。将无菌棉签，浸于生理盐水中，插入大鼠阴道约0.5 cm，稍旋转，涂于玻片上，置于95%乙醇中湿固定15 min，自然风干后，行苏木素-伊红（HE）染色并观察。

2.3 大鼠动情周期观察 造模10 d后，连续行2个性周期（每个周期5 d）的大鼠阴道脱落细胞涂片，观察动情周期的变化，动情前期涂片特征：以小、圆、有核上皮细胞（鳞状上皮细胞）存在为特征；动情期：以不规则（角质化）的鳞状上皮细胞为特征；动情后期：以白细胞和角质化细胞为特征；动情间期：白细胞和圆上皮细胞出现为特征。参照文献，大鼠失去规律的动情周期，或持续处于动情间期，则提示无排卵［2］。

2.4 标本采集 造模第20天，晚8时开始禁食不禁水。翌日尾静脉采血，分离血清用于T、FSH、LH检测，随后正常组及造模组各取2只麻醉（10%水合氯醛，3 mL／kg）行腹腔注射麻醉取卵巢，进行卵巢组织形态学观察。第48天晚8时开始禁食不禁水，翌日称重麻醉，腹主动脉采血4 mL，分离血清用于性激素检测。分别完整取出双侧卵巢，剪去卵巢周围脂肪组织，称重并观察其外观。将大鼠双侧卵巢用PBS冲洗后置于EP管中，加入4%多聚甲醛，使其浸泡其中，待病理切片，用于卵巢组织形态学观察。

2.5 观察指标及方法

2.5.1 卵巢指数 于末次给药后，晚8时开始禁食不禁水，于次日晨称重。分别完整取出双侧卵巢，称重并计算卵巢指数。

2.5.2 卵巢组织形态学观察 体式镜下观察卵巢组织外观；选取卵巢的最大平面进行石蜡包埋，蜡块分别以4 μm厚度进行连续切片，行苏木素-伊红（HE）染色并观察。

2.5.3 血清性激素检测 采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中 T、FSH、LH 的含量，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。在酶标仪上进行检测，根据酶联免疫反应后显色的深浅即吸光度值的大小判断标本中待测抗体或抗原的浓度。

2.6 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件分析。若计量资料符合正态分布，数据以表示，2组比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，满足方差齐性检时，采用LSD方法分析比较组间差异，方差不齐时，两两比较选择Dunnett T3方法；若不符合正态分布则进行两样本或多组秩和检验，数据以中位数和四分位数描述。

3 结 果

3.1 大鼠体质量比较 见表1、2。

表1 第21天正常组和造模组大鼠体质量比较g

表1 第21天正常组和造模组大鼠体质量比较g

组别正常组造模组鼠数10 18第21天186.418±15.176 189.457±17.016

表2 第49天3组大鼠体质量比较g

表2 第49天3组大鼠体质量比较g

组别正常组模型组Ⅰ模型组Ⅱ鼠数8 8 8第48天252.910±14.367 252.718±16.854 267.363±26.185

3.2 正常组和造模组大鼠动情周期变化 正常组动情周期变化规律，按照动情间期、动情前期、动情期、动情后期规律进行；造模组动情周期失去规律性。见图1～2。

3.3 体质量和血清性激素水平比较 见表3～4。

3.4 卵巢组织HE染色 第21天正常组镜下可见各级卵泡，成熟卵泡结构完整（箭头所指），有卵丘、卵细胞及放射冠，卵巢颗粒细胞层多为8～9层；造模组镜下可见卵巢呈多囊样变，闭锁卵泡增多，无成熟卵泡（箭头所指），无卵母细胞及卵丘，卵巢颗粒细胞层减少且排列稀疏。第49天正常组镜下可见各级卵泡，成熟卵泡结构完整（箭头所指），有卵丘、卵细胞及放射冠，卵巢颗粒细胞层多为8～9层；模型组Ⅰ及模型组Ⅱ镜下可见卵巢呈多囊样变，无成熟卵泡（箭头所指），无卵母细胞及卵丘，卵巢颗粒细胞层多为1～3层，且排列稀疏，少见黄体。与模型组Ⅰ相比，模型组Ⅱ黄体数量较少，卵泡呈变形状态。见图3～4。

表3 第21天正常组和造模组大鼠血清FSH、T、LH水平

表3 第21天正常组和造模组大鼠血清FSH、T、LH水平

注：与正常组比较，1） P＜0.01。

组别正常组造模组鼠数10 18体质量／g 186.418±15.176 189.457±17.016 T ／（nmol／L）139.388±8.862 169.377±5.7521）FSH／（IU／L）27.918±1.702 27.478±2.245 LH／（ng／L）34.356±1.465 43.494±1.7581）

表4 第49天3组大鼠血清FSH、T、LH水平

表4 第49天3组大鼠血清FSH、T、LH水平

注：与正常组比较，1） P＜0.01；与模型组Ⅰ比较，2） P＜0.01。

组别正常组模型组Ⅰ模型组Ⅱ鼠数8 8 8体质量／g 252.910±14.367 252.718±16.854 267.363±26.185 T ／（nmol／L）149.402±8.441 169.821±10.1801）194.722±11.1441）2）FSH／（IU／L）25.480±0.875 18.526±0.7751）19.483±0.5551）LH／（ng／L）28.023±1.122 33.170±2.0041）32.086±2.0701）

3.5 第49天卵巢组织形态观察 正常组大鼠的卵巢形态正常，色泽红润；模型组Ⅰ卵巢表面苍白，卵巢表面可见单个或较多的囊性扩张卵泡；模型组Ⅱ呈乳白色样变，见图5。

3.6 第49天3组大鼠卵巢指数和黄体数比较 见表5。

表5 第49天3组大鼠卵巢指数和黄体数比较

表5 第49天3组大鼠卵巢指数和黄体数比较

注：与正常组比较，1） P＜0.05，2） P＜0.01；与模型组Ⅰ比较，3） P＜0.05，4） P＜0.01。

组别正常组模型组Ⅰ模型组Ⅱ黄体数／个21.875±4.622 16.250±5.1391）6.417±4.3342）4）鼠数8 8 8卵巢指数0.043±0.008 0.053±0.006 0.037±0.0163）

4 讨 论

PCOS是常见的妇科内分泌综合征，临床主要表现为月经不调、不孕、高雄激素血症等，据流行病学调查显示，其在国内的发病率为8.25%，不孕率为27.8%［11］。受临床采集样本的限制，目前国内外相关研究均以PCOS的动物实验为主，PCOS的确切病因及病理生理机制目前尚不明确，因此为深入探讨PCOS的病因、病理生理及药物治疗机制，有必要建立PCOS动物模型。当前认可的PCOS造模方法主要包括雄激素法、雌激素法、胰岛素（INS）联合人绒毛膜促性腺激素（HCG）造模法等［12-14］，其中以DHEA雄激素造模法最多见。然而大鼠自愈能力较强，这对药物研究而言有较大的误导性［15］。 张莹等［6］为避免模型恢复排卵，在药物干预的同时每天持续注射DHEA，但该模型是否存在自愈未见报道，不同时长DHEA诱导PCOS模型的性激素水平及卵巢形态学差异也不明确。因此，本研究采用不同时长DHEA诱导PCOS大鼠模型，选取20 d及48 d两个时间点，比较模型的特点，为选择合适的诱导时长提供实验依据。

研究发现，第21天造模组T、LH水平高于正常组（P＜0.01），而FSH无明显差异，HE染色观察发现卵巢组织结构呈多囊样变，根据其性激素水平及卵巢形态学改变，证明PCOS模型建立成功，这与他人研究结果一致［16］。比较第21天及第49天血清性激素水平可以发现，模型组Ⅰ停止造模后，其T、LH与正常组比较仍有统计学差异，模型组Ⅰ及模型组Ⅱ的FSH水平低于正常组（P＜0.01）。究其原因，可能是DHEA不溶于水，只能溶于油剂，注射后短期内很难完全吸收。PCOS患者激素功能紊乱是由于下丘脑-垂体-卵巢轴调节功能异常，卵巢内过高的雄激素会使LH分泌呈正反馈，而FSH呈负反馈，使 LH／FSH 比例增大［17］。 本次实验中，DHEA 为外源性雄激素，尚未达到使FSH产生负反馈。因此，到后期完全吸收后，高雄激素水平抑制FSH的释放［18］。 结果表明 DHEA 20 d诱导的PCOS模型，其药物未被完全吸收，如要研究其激素水平，需预留一定时间使其吸收。

此外，本研究通过体式显微镜观察各组卵巢组织形态，发现与模型组Ⅰ相比，模型组Ⅱ黄体数量较少，卵泡呈变形状态。卵巢表面苍白，是雄激素刺激卵巢白膜而胶原化所致［18］，模型组Ⅱ白膜呈乳白色样变，其白膜厚度比模型组Ⅰ厚，考虑与雄激素的持续刺激有关。卵巢组织形态结构变化上，模型组Ⅰ及模型组Ⅱ镜下可见卵巢呈多囊样变，无成熟卵泡，无卵母细胞及卵丘，卵巢颗粒细胞层多为1～3层，且排列稀疏，少见黄体。模型组Ⅰ、模型组Ⅱ黄体个数低于正常组（P＜0.05，P＜0.01），模型组Ⅱ黄体个数少于模型组Ⅰ（P＜0.01）。计算各组大鼠卵巢指数发现，模型组Ⅰ卵巢指数高于正常组，差异无统计学意义，与他人研究结果相符［19］。同时发现模型组Ⅱ卵巢指数低于正常组及模型组Ⅰ（P＜0.05）。分析其原因，可能是垂体活动过度，促性腺素分泌异常，卵泡消耗加速，导致卵巢萎缩，形成纤维化的白色组织，囊状卵泡的持久压迫，也会使卵巢萎缩［20］。可见，DHEA持续造模会导致卵巢萎缩。

因此，采用DHEA诱导20 d的PCOS大鼠模型，经历4周后，模型不存在自愈，与持续造模相比更加简便易行。同时诱导20 d的PCOS模型卵巢形态结构以及激素水平变化也更符合临床表现。