郫县豆瓣后发酵过程中脂肪和脂肪酸代谢变化

冉玉琴,陈 雨,彭 杰,董 锋,杨国华,张 良,*

(1.西华大学食品与生物工程学院,食品生物技术四川省高校重点实验室,四川成都 610039; 2.四川品品食品有限公司,四川成都 611732; 3.四川省丹丹郫县豆瓣集团股份有限公司国家企业技术中心,四川省豆瓣酿制工程实验室,食品用酶生物发酵技术国家地方联合工程研究中心,四川成都 611732)

郫县豆瓣是一种中国传统地方特色发酵食品,主要是由二荆条辣椒、蚕豆、小麦粉和盐等原料制成[1-2],以其味辣香醇、黏稠绒实、红棕油亮、酱香浓郁等特点，在我国酱类产品中独树一帜,是川菜中重要的调味料,被誉为“川菜之魂”[3]。作为一种极具地方特色的发酵型调味品,其特殊的发酵工艺、原料及环境因素造就了郫县豆瓣独特的风味品质[4]。郫县豆瓣的生产工艺包括前发酵和后发酵2个阶段:前期发酵主要是指蚕豆霉瓣子的制曲和辣椒坯的预处理,制作周期分别为40 d和6个月左右。后熟发酵主要是将成熟霉瓣子和成熟辣椒坯按比例配料混合,加入适量食盐和水,进入发酵池发酵,经过一定时期的翻晒和陈化,经过郫县豆瓣特有的翻、晒、露工艺成为深受欢迎的产品。红豆瓣成熟其为6个月到1年左右,成熟一年以上为黑豆瓣[5]。

脂肪作为郫县豆瓣不可或缺的部分,赋予其油亮的特性,增加人民群众的消费意向。在发酵过程,大量微生物分泌的相关酶系将脂肪分解成脂肪酸和甘油[6]。有研究表明,摄入适当比例的饱和、单不饱和、多不饱和脂肪酸可预防心脑血管疾病、癌症、关节炎等[7];脂肪酸作为郫县豆瓣一些风味物质的前体成分,更是醛类、醇类、呋喃类等的重要来源[8]。

郫县豆瓣作为一种国家地理标志产品,国外对于它的研究几乎没有。目前,国内对于郫县豆瓣的研究主要集中在香气成分分析[9-10]、后发酵期真菌细菌的演替变化分析[11-12]和黄曲霉毒素的分析[13]以及有机酸[14]、氨基酸[15]的种类及含量的研究分析。针对郫县豆瓣脂肪酸的报道较少,仅有部分涉及挥发性脂肪酸[16],但没有对不同发酵时间点郫县豆瓣的脂肪酸进行定量及比对分析。因此,本课题通过追踪8个不同后发酵时间的郫县豆瓣,利用气相色谱仪测定其脂肪酸的种类和含量,采用主成分分析法研究其组成差异,以期为郫县豆瓣后发酵工艺改良提供科学依据,也为进一步挖掘地域特色发酵产品的科技内涵提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

郫县豆瓣 取自四川省丹丹郫县豆瓣集团股份有限公司生产车间;石油醚(60～90 ℃)、硫酸、甲醇、正己烷 均为分析纯,成都市科隆化学品有限公司;十一碳酸甘油三酯、37种脂肪酸甲酯 均为色谱纯,斯坦福分析化学公司。

超低温冰箱 美国Thermo Fisher Scientific公司;TNG-T98型真空干燥仪 太仓市华美生化仪器厂;JXFSTPRP-24型研磨仪 上海警信科技有限公司;Forma 900 series型全自动索氏抽提仪 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;XW-80A型涡旋混合器 四川蜀科仪器有限公司;7820A型气相色谱仪 美国安捷伦科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 采样及预处理 分别选取后发酵1、3、6、9、12、18、24和36月(M)的郫县豆瓣,取样时选取上层(距表面0～20 cm)、中层(距表面30～50 cm)、下层(距池底0～20 cm)的郫县豆瓣,混合均匀后密封,4 ℃低温运至实验室。经冷冻干燥后,粉碎备用。

1.2.2 粗脂肪的提取 采用GB 5009.6-2016《索氏抽提法》[17],准确称取2.00 g样品于索氏提取仪,加入60 mL石油醚;提取条件为:温度75 ℃,经浸泡20 min、淋洗60 min、回收溶剂10 min、蒸干5 min后取出,80 ℃烘干至恒重,计算粗脂肪含量。

式中:A0为豆瓣粉样品质量,mg;A1为浸提杯质量,mg;A2为含有豆瓣油脂的浸提杯的质量,mg。

1.2.3 脂肪酸分析 甲酯化反应[18]:称取0.01 g上述油脂于10 mL具塞试管中,加入1 mL 2.5 mol/L内标溶液(十一碳酸甘油三酯)与3 mL 2.5 mol/L 硫酸-甲醇溶液,70 ℃水浴加热至油样溶解。期间每10 min涡旋振荡30 s,冷却至室温后加入1 mL正己烷多次振荡萃取,合并上清液过0.2 μm微孔滤膜后待测。

1.2.4 色谱条件 气相色谱仪配备FID 检测器;ZB-FAME毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.2 μm);检测器温度280 ℃;升温程序:50 ℃保持2 min,以8 ℃/min 升温至180 ℃,保持5 min后,以5 ℃/min 升温至230 ℃,保持5 min;载气为氢气,流速1.2 mL/min;燃气为氢气,流速30 mL/min;空气流速300 mL/min,辅助气体为氮气,流速25 mL/min。根据混合标准品确定保留时间,以十一碳酸甘油三酯为内标物质进行分析处理。

式中:Xi为试样中脂肪酸甲酯i含量(g/100 g);Fi为脂肪酸甲酯i的响应因子;Ai为试样中脂肪酸甲酯i的峰面积;AC11为试样中加入的内标物十一碳酸甲酯峰面积;ρC11为十一碳酸甘油三酯浓度(mg/mL);VC11为试样中加入十一碳酸甘油三酯体积(mL);1.0067为十一碳酸甘油三酯转化成十一碳酸甲酯的转换系数;m为试样的质量(mg)。

1.3 数据处理

实验设3次重复,测定结果以平均值(误差的形式表示。数据处理用SPSS 19.0软件进行方差分析(ANOVA)与主成分分析,通过Pearson相关系数分析脂肪酸之间的相关性,采用Origin 18.0绘图。

2 结果与分析

2.1 不同后发酵期郫县豆瓣的粗脂肪含量

如图1为不同后发酵期郫县豆瓣粗脂肪含量,结果表明:粗脂肪在后发酵期间变化不大,含量为3.46%～4.29%(w/w),与豆酱(4.26%)[19]、酱油(6.15%)[20]等其他豆类发酵调味品含量差异不大。随着后发酵进行,粗脂肪含量呈现先下降后上升再下降的趋势,究其原因,可能是前期微生物演替过程比较剧烈,消耗了大量的粗脂肪,但随着代谢的减弱、酶系的作用以及郫县豆瓣特有的“翻、晒、露”工艺,使得郫县豆瓣中大量的可溶物溢出,导致了粗脂肪的含量变化。

图1 不同后发酵时期郫县豆瓣酱的粗脂肪含量Fig.1 Fat contents of Pixian soybean pasteduring different post-fermentation stages

有报道表明,假单孢菌[21]、葡萄球菌以及一些曲霉[22]都具有一定产脂肪酶的能力,这些微生物在郫县豆瓣后发酵期也广泛存在[12,23],这可能造成了郫县豆瓣粗脂肪的减少。另外,脂肪酶属于羧基水解酶类,能将天然底物油脂逐步地水解成甘油、脂肪酸和甘油单酯或二酯[24]。随着后发酵进行,可溶物的溶出、pH的降低[25]、温度随季节天气的变化[26]等,都会影响微生物代谢脂肪酶的能力以及脂肪酶的活性。

2.2 不同后发酵期郫县豆瓣的脂肪酸组成

图2为6个月后发酵期郫县豆瓣样品的气相色谱图。表1为8个不同后发酵时期的郫县豆瓣样品中脂肪酸组成。由表1可知,不同后发酵期的郫县豆瓣样品共检出9种脂肪酸,含量存在一定差异。总脂肪酸呈现先下降后上升再下降后上升的动态变化,这与韩国大酱持续升高存在差异[27]。这可能是由于制作韩国大酱和郫县豆瓣酱的原辅料、发酵工艺以及微生物区系的不同所导致的。在24～36 M,脂肪酸含量上升幅度较大,可能是郫县豆瓣特有的长时间“翻、晒、露”工艺,使得水分含量减少,导致其含量升高。

表1 不同后发酵时期郫县豆瓣脂肪酸组成及含量(mg/g)Table 1 Fatty acid composition and contents of Pixian soybean paste at different post-fermentation stages(mg/g)

图2 郫县豆瓣样品中脂肪酸组分气相色谱图 Fig.2 Gas chromatogram of fatty acid componentsin Pixian soybean paste samples注:1:十一碳酸甘油三酯(11.587 min);2:月桂酸甲酯(12.725 min);3:肉豆蔻酸甲酯(14.841 min);4:棕榈酸甲酯(16.781 min);5:棕榈油酸甲酯(17.148 min);6:硬脂酸甲酯(18.574 min);7:油酸甲酯(18.859 min);8:反式油酸甲酯(18.935 min);9:亚油酸甲酯(19.511 min);10:亚麻酸甲酯(20.427 min)。

不同后发酵期郫县豆瓣脂肪酸,含量最高的是亚油酸(4.963～11.668 mg/g),依次是油酸(1.186～2.706 mg/g)和棕榈酸(0.751～1.649 mg/g),这与豆豉(亚油酸55.941%、油酸21.592%、棕榈酸13.729%)[28]的含量相似。脂肪酸含量普遍较低的是月桂酸(0.030～0.113 mg/g)、肉豆蔻酸(0.131～0.305 mg/g)、棕榈油酸(0.056～0.142 mg/g)、反式油酸(0.126～0.230 mg/g),反式油酸和棕榈油酸在整个后发酵期间含量变化不大,处于一个相对稳定的状态;月桂酸和肉豆蔻酸呈起伏变化;不饱和脂肪酸亚油酸、油酸、亚麻酸呈整体下降趋势。

在1～6 M期间,脂肪酸含量逐步下降,并在6 M处达到最低值,究其原因,一方面可能是原料蚕豆瓣中含有一定量的脂肪酸;另一方面可能是来自于微生物与酶的作用,使1 M脂肪酸含量较高。但随着发酵的进行,部分微生物由于不适应新的环境或完成其代谢过程而消失[8],使得脂肪酸的形成减缓。直至发酵6 M时,“翻、晒、露”过程中大量环境微生物的进入,使郫县豆瓣发酵体系达到一个相对稳定的状态,致使脂肪酸含量在此时到达最低点。

亚油酸(C18∶2)是郫县豆瓣发酵过程中含量最丰富的多不饱和脂肪酸,相对百分比含量高达56.90%～69.60%。亚油酸可降低氧化损伤,通过与胆固醇结合,还可维持血液胆固醇正常的运转和代谢、预防动脉粥样硬化、糖尿病和心脑血管疾病[29-32]。此外,亚油酸和油酸不仅是必需脂肪酸,也可通过氧化、酶系作用分解生成醛类、醇类、酮类及呋喃类化合物[7],适量的油酸和亚油酸含量可显著增加挥发性风味物质的组成及总量,过高则易产生不愉快气味[33],对于郫县豆瓣酱独特风味物质生成具有一定贡献。

2.3 不同后发酵期郫县豆瓣脂肪酸相关性分析

为了更直观的解释后发酵过程中郫县豆瓣样品中脂肪酸的变化情况,对8个郫县样品9种脂肪酸成分进行相关性分析,结果如表2所示。大部分脂肪酸含量之间存在正相关关系(仅1个负相关),且相关系数大多大于0.5,表明脂肪酸之间具有较强的正相关性。硬脂酸、油酸、反式油酸、棕榈油酸等脂肪酸之间存在极显著正相关(P<0.01);肉豆蔻酸与硬脂酸、油酸、反式油酸、亚油酸存在显著正相关(P<0.05),与亚麻酸呈极显著正相关(P<0.01);棕榈油酸与亚油酸呈显著正相关(P<0.05);棕榈酸、月桂酸与其他脂肪酸均不存在显著相关性。由于指标之间均存在不同程度的相关性,所以可以利用主成分分析对这些变量即原始的脂肪酸含量进行降维处理,来研究豆瓣中脂肪酸与不同后发酵时期的关系。主成分的特征值和贡献率见表3。由表3可知,前2个主成分的贡献率分别为75.09%、15.21%,累积贡献率为90.30%,确定提取2个主成分最合适,可较好反映所有脂肪酸组成的基本信息。

表2 脂肪酸指标间的皮尔森相关系数Table 2 Pearson correlation coefficient between fatty acid indicators

表3 主成分的特征值和贡献率Table 3 Eigen values and contribution rateand of the principal components

主成分的载荷矩阵见表4。由表3和表4各特征向量值可知,第一主成分PC1主要反映C18∶1t、C18∶0、C18∶1的变异信息,故可将PC1命名为十八碳脂肪酸因子F1。第二主成分主要反映C12∶0和C16∶0的变异信息,故可将PC2命名为饱和脂肪酸因子F2。

表4 主成分载荷矩阵Table 4 Loading matrix of principal components

图3为主成分分析得到的不同发酵期脂肪酸组分的分值图。从图3可以看出,不同样品在横、纵坐标的距离各不相同且没有重叠,说明8个不同后发酵期郫县豆瓣样品得到了较好的区分。其中,样品在坐标上的距离随时间变化而变化,因而可大致将后发酵期脂肪酸的变化分为三个阶段,分别为后发酵前期(1～3 M)、中期(6～9 M)、后期(12～36 M),并且随着发酵时间的延长脂肪酸变化程度减弱,究其原因,可能是由于在后发酵前期,各种微生物与酶系的作用代谢过程较快,仅相隔一两个月其脂肪酸含量都存在显著差异;随着发酵的进行,底物的消耗及pH的降低[28]，影响发酵体系中相关酶活性及微生物产酶能力,导致后发酵中期、后期脂肪酸含量变化逐渐减缓。

图3 郫县豆瓣后发酵过程中脂肪酸组分的分值图Fig.3 Score plots of fatty acid compositionduring post-fermentation of Pixian soybean paste

3 结论

郫县豆瓣在后发酵过程中粗脂肪含量变化为3.46%～4.29%，其中饱和脂肪酸以棕榈酸为主,不饱和脂肪酸以亚油酸、油酸为主,且不饱和脂肪酸含量远远高于饱和脂肪酸,另外还含有少量其他种类脂肪酸如:月桂酸、亚麻酸、棕榈油酸、硬脂酸等。基于主成分分析法,提取得到前两个主成分贡献率分别为75.09%、15.21%,累积贡献率达90.30%,可较好反映所有脂肪酸组成的基本信息。脂肪酸含量在后发酵期的变化可大致分为三个阶段,依次分别为1～3、6～9、12～36 M,可称为后发酵前期、发酵中期和发酵后期。在发酵过程中,一些不饱和脂肪酸还可氧化分解为挥发性香味物质,对后发酵过程中香气成分的变化具有潜在影响。相对于郫县豆瓣中其他呈香呈味物质(氨基酸、有机酸),部分发酵节点上脂肪酸的含量相对稍高。本研究结果为郫县豆瓣工业化生产控制产品品质与建立生产质量控制体系提供了科学依据。同时脂肪酸还是一些霉菌的代谢物质,要系统阐明发酵过程中脂肪酸的代谢通道，还需结合发酵过程中参与转化的真菌细菌进一步研究。