低温等离子体对金黄色葡萄球菌肠毒素B的灭活作用

潘 迪,张大革,孙运金,马挺军

(北京农学院食品科学与工程学院,北京 102206)

等离子体杀菌技术是近年来出现的一项新的物理杀菌技术,相对于其他灭菌方法,低温等离子体的突出特点是操作温度低、灭菌时间短、无残留毒性,能广泛应用于多种材料和物品的灭菌[1-2]。目前,低温等离子体破坏细菌和真菌等微生物的机制一般认为是低温等离子体中的带电粒子和活性氧在灭菌过程中起主要作用,带电粒子可击穿细菌等微生物外部结构(细胞壁和细胞膜),而活性氧组分(单原子氧、臭氧、中性亚稳态氧分子、氢氧自由基等)可与细菌等微生物外部结构中蛋白质、核酸、脂质等大分子反应,产生刻蚀作用,破坏外部结构,导致微生物细胞质内容物的漏出,从而引起微生物死亡[3-5]。有研究表明,低温等离子体对细菌繁殖体、细菌芽孢、毒素等都具有良好的杀灭效果[6-8]。其中,介质阻挡放电(Dielectric barrier discharge,DBD)低温等离子体因放电面积较大、电子密度高、设备简单、适合大规模工业应用,已成为国内外研究的热点[9-10]。

金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal Enterotoxin B,SEB)作为一种超抗原,是葡萄球菌分泌的主要外毒素,也是葡萄球菌引起的主要致炎性物质[11]。SEB分子量为28.4 kDa,包含有239个氨基酸片段,等电点为8.6,其结构主要由通过环状结构连接的2个区域构成,具有耐高温、酸碱和蛋白水解酶等特点,产毒量最大(500 μg/mL)[12-13]。一般情况下,人体食入0.004 μg/kg剂量就会受到呕吐中枢的刺激而引发呕吐、腹痛、腹泻等临床症状,而0.02 μg/kg剂量就足以致死[14],因此对SEB进行处理具有重大的现实意义。

近年来,国内外降解肠毒素的研究主要集中在酶降解或微生物降解上。Fujikaw等[15]采用从原料乳中分离的铜绿假单胞菌降解葡萄球菌肠毒素A(SEA),结果发现生乳中铜绿假单胞菌产生的蛋白酶对SEA有降解作用。吴拥军等[16]证明了耐氧双歧杆菌对大肠杆菌肠毒素具有生物降解作用,它可以把肠毒素(一种小分子的小肽)作为生长所需的营养物质使其分解。然而,关于物理降解肠毒素的方法鲜有报道,尤其是采用低温等离子体物理降解SEB的研究尚未见报道。因此,本研究在大气压下以空气为工作气体,以DBD方式产生低温等离子体,用低温等离子体处理SEB后注射给小鼠,通过测定小鼠的存活时间、体重、抗氧化酶活性,评价低温等离子体对金黄色葡萄球菌肠毒素B的灭活效果及其对小鼠存活时间影响的潜在机理,为今后低温等离子体降解SEB的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品 纯度100%,用于攻毒时稀释10倍,美国Sigma公司;SPF级雌性BALB/c小鼠 6～8周龄,体重(20±2) g,50只,北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物合格证号为SCXK(京)2018-0001;ELISA试剂盒、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;Tris-HCl、EDTA-2Na 北京Solarbio公司;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、蔗糖、氯化钠 均为国产分析纯。

介质阻挡放电低温等离子体 北京农学院食品科学与工程学院自制;Tektronix TDS2002型示波器、Tektronix P6015a型高压探头(1/1000) 上海顺测电子有限公司;24 mm×50 mm盖玻片 上海睿安生物科技有限公司;LGR16-W型台式高速冷冻离心机 北京京立离心机有限公司;(ACCULAB)ALC-2100.2型电子天平 深圳市朗普电子科技有限公司;BCD-288WSL型卡萨帝冰箱 青岛海尔股份有限公司;DW-86L578J型超低温冰箱 广州科晓科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 低温等离子体的产生 采用的实验装置,如图1所示。系统主要由高压电源、放电电极和阻挡介质等组成。高压电源的中心频率为50 kHz,输出的峰值电压为3 kV;采用厚度为5 mm,直径(Φ)为5 cm锡箔平板做电极;阻挡介质是厚度为1.5 mm,直径(Φ)9 cm的石英玻璃;电极间气隙5～10 mm,实验中放电间距取8 mm。介质阻挡放电过程中的放电电压、放电频率的测量通过示波器和高压探头进行同步显示波形和测量值。电极装置置于超净工作台内,电源装置置于超净工作台外。

图1 介质阻挡放电低温等离子体灭活SEB装置图Fig.1 Diagram of SEB device inactivated bydielectric barrier discharge low-temperature plasma

1.2.2 低温等离子体处理SEB 称取100 μg SEB溶于5 mL 0.05 mol/L PBS溶液(磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲溶液,pH=7.0)中,即SEB的质量浓度为20 μg/mL。用移液枪分别将50 μL的SEB溶液滴于规格为24 mm×50 mm的4片盖玻片上。1片作为模型组不处理,3片作为处理组置于低温等离子体发生装置中分别处理10、20和30 min。处理完之后,分别立即用950 μL的PBS溶液将SEB溶液冲入试管中。空白对照组为PBS溶液。试验在常压下的空气中进行,环境条件为室温20 ℃,相对湿度60%,每次处理均重复三次。

1.2.3 SEB含量的测定 将ELISA试剂盒中所有试剂的温度恢复至室温,然后按照试剂盒的说明书在室温下进行操作,测定低温等离子体处理SEB后的浓度。

1.2.4 SEB休克小鼠模型的建立及其生存时间、体重的测定 将50只雌性BALB/c小鼠随机分为5组,每组10只。一组作为空白对照组,每只腹腔注射1 mL PBS溶液;一组作为阳性组,每只腹腔注射未处理的SEB溶液1 mL(浓度为1 μg/mL);另外3组每组每只分别腹腔注射经低温等离子体处理10、20、30 min后的SEB溶液1 mL。注射后观察各组小鼠存活情况,记录存活时间(总观察时间120 h);并在24 h对每只小鼠进行称重。

1.2.5 10%组织匀浆的制备 在120 h观察期内,如果小鼠死亡,则立即取小鼠肝脏于-80 ℃冰箱保存;如果小鼠未死亡,则观察期结束后立即处死小鼠,取其肝脏;然后在同一时间下制备组织匀浆液,整个操作在4 ℃条件下进行。首先,在冷室4 ℃下取小鼠肝脏组织块于冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称0.2 g放入10 mL的小烧杯内;然后用移液器移取1.2 mL的匀浆介质(pH7.4,0.01 mol/L Tris-HCl,0.0001 mol/L EDTA-2Na,0.01 mol/L蔗糖,0.8%的氯化钠溶液)于烧杯中,用眼科小剪尽快剪碎组织块(冰水浴中操作);再将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,用0.6 mL匀浆介质冲洗残留在烧杯中的碎组织块,倒入匀浆管中进行充分匀浆6～8 min。将制备好的10%匀浆用4 ℃冷冻离心机3000 r/min离心10～15 min,取上清置于4 ℃冰箱保存。

1.2.6 小鼠肝脏中抗氧化指标的测定 以1.2.5制备的匀浆上清液为样品,按照试剂盒操作测定小鼠肝脏中CAT、SOD、GSH-PX的活力。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 SEB含量测定

由表1可知,与阳性组相比,低温等离子体处理SEB后,各组SEB含量显著降低(P<0.05),处理30 min时SEB含量降解率最大,为96%。这表明等离子体对SEB具有破坏作用,破坏效果具有时间依赖性。

表1 等离子体处理前后SEB含量Table 1 The SEB content before and after plasma

2.2 低温等离子体不同时间处理SEB后对小鼠生存时间的影响

在实验过程中,空白对照组小鼠在观察时间内无一例死亡,阳性组小鼠(即等离子体处理时间为0 min)腹腔注射SEB后,身体发抖,口唇发紫,活动开始减少,24 h的死亡率为100%。低温等离子体不同时间处理SEB后对小鼠生存时间的影响见图2。与阳性组相比,3个处理组小鼠平均生存时间显著延长(P<0.05),且等离子体处理时间越长,其平均生存时间越久,分别为阳性组的2.50倍、3.33倍、5.00倍,其原因可能是等离子体产生的活性成分,如活性氧、·OH,能够对大分子物质蛋白质、酶、核酸等产生氧化损伤和破坏[17-18],它们通过夺取SEB蛋白上氢原子,使其变性,从而降低了其含量,减少了SEB毒害作用,间接延长了小鼠的存活时间。实验还发现,处理SEB 30 min时小鼠的平均存活时间为120 h,与空白对照组相同,这表明该组小鼠体内SEB含量与空白对照组相近,该结论与2.1中结果相符。

图2 低温等离子体不同时间处理SEB后对小鼠生存时间的影响(n=10)Fig.2 Effects of SEB that treated with low-temperature plasmaat different times on mice survival time(n=10)注：不同字母表示数值之间存在显著性差异(P<0.05)。

2.3 低温等离子体不同时间处理SEB后对小鼠体重的影响

小鼠体重的变化也可反映SEB的活性,从而间接反映低温等离子体对SEB的破坏效果。由表2可知,阳性组与空白对照组相比,小鼠平均体重极显著下降(P<0.01),并且其平均体重与开始实验时(20±2) g相接近,这表明SEB对小鼠生长有毒害作用,抑制其体重增加。与阳性组相比,处理SEB 10、20 min组小鼠平均体重均增加,但差异不显著(P>0.05),处理SEB 30 min组小鼠平均体重显著增加(P<0.05),这进一步表明等离子体处理对SEB有一定破坏作用,从而降低了处理组SEB对小鼠体重增加的抑制。

表2 低温等离子体不同时间处理SEB后对小鼠体重的影响Table 2 Effects of SEB that treated with low-temperatureplasma at different times on mice body

2.4 低温等离子体不同时间处理SEB后对小鼠肝脏抗氧化酶活性的影响

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性构成一级抗氧化防御系统,在生物系统的总防御机制和防御策略中起着关键和基础的作用[19]。由表3可以看出,与空白对照组相比,阳性组CAT、GSH-Px活性均显著降低(P<0.05),SOD活性极显著降低(P<0.01)。与阳性组相比,处理SEB 10 min组对CAT、SOD、GSH-Px活性均无显著影响(P>0.05);处理SEB 20 min组对CAT、GSH-Px活性均无显著影响(P>0.05),SOD活性显著提高(P<0.05);处理SEB 30 min组CAT、GSH-Px活性显著提高(P<0.05),SOD活性极显著提高(P<0.01)。由此可知,低温等离子体处理SEB对直接注射SEB引起的机体中SOD、CAT、GSH-PX活性的降低具有缓释作用,且具有时间依赖性。在等离子体处理SEB 3.0 min时小鼠体内CAT、SOD、GSH-Px活性均达到最大值,与阳性组相比分别增加了69.33%、74.93%、47.92%。有研究表明,SOD水平与机体衰老呈正相关,GSH-Px具有保护细胞膜作用[20-21]。本实验结果表明,各处理组CAT、SOD、GSH-Px活性与阳性组相比均有所提高,说明低温等离子体处理组能够改善机体的抗氧化能力,增强免疫力和细胞稳定性,延缓衰老,进而延长小鼠的存活时间。这与包晓玮等[21]通过提高SOD、GSH-Px的活性来延缓小鼠衰老的结果相似。且等离子体处理SEB后,小鼠平均生存时间的延长可能与其体内抗氧化酶活性的提高有关。

表3 低温等离子体不同时间处理SEB后对小鼠肝脏抗氧化酶活性的影响Table 3 Effects of low temperature plasma treatment with SEB on antioxidant enzyme activity in mouse

3 结论

本实验将SEB注射小鼠建立小鼠休克模型评价低温等离子体对SEB的灭活作用。直接注射SEB的模型小鼠出现了阳性组生存时间和平均体重低于空白对照组,小鼠肝脏中CAT、SOD、GSH-Px活性降低,这些变化表明SEB对小鼠机体产生了毒害作用,造成了体内组织的氧化损伤,进而缩短了小鼠的存活时间。

通过将低温等离子体处理的SEB注射小鼠后,3个处理组小鼠的平均生存时间和平均体重与阳性组相比均有所提高,且小鼠肝脏中CAT、SOD、GSH-Px活性也高于阳性组,在处理SEB 30 min时效果最显著。以上结果综合表明,低温等离子体处理可以降低SEB的含量,且随着处理时间的延长,对SEB的降解率越大,从而提高小鼠体内抗氧化酶活性,增强机体免疫力和细胞的稳定性,延缓衰老,进而延长小鼠的存活时间,且其存活时间具有处理时间依赖性。但是,到目前为止低温等离子体破坏肠毒素B的机制尚不清楚,仍需深入探讨。