爬山虎果实中原花青素提取工艺优化

谢文杰,张 磊,胡璐曼,骆丽如,曾泽南,唐忠海

(湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙 410128)

爬山虎(ParthenocissustricuspidatePlach)又名“地锦”、“爬墙虎”,为葡萄科多年生落叶藤本植物。其根、茎可入药,能破瘀血、消肿毒[1],成熟的果实为紫黑色球形浆果[2],富含原花青素[3-4]。

花青素(Anthocyanidin),又名花色素,为3,5,7-三羟基-2-苯基苯并吡喃阳离子结构,是一种广泛存在于自然界植物中的水溶性天然色素,同时也是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一,属于黄酮类化合物。花青素这个名称是Marquart在1835年给车矢菊花朵中提取出的蓝色物质命名的时候提出来的,并且沿用至今现在为同类物质的统称[5]。原花青素是植物中广泛存在的一类多酚化合物的总称,具有抗氧化、抗炎症、抗过敏、增强机体免疫力、维持正常视觉、抗热应激、清除机体自由基、降低血脂以及预防心血管系统疾病等重要生理调节功能[6-8]。原花青素色泽纯正、食用安全、益于人体健康,主要用于食品工业、药品制造和化妆品生产等领域[7,9-10]。另有研究证实,原花青素能够有效防治包括心脏病、关节炎等在内的80多种由体内自由基所引起的疾病;能够有效防止食品在贮藏、运输等过程的氧化变质,尤其是油脂和富脂食品的酸败;此外,原花青素还具有抗菌、抗肿瘤、防糖尿病、防腹泻、促进生长、益智健脑、减轻疲劳、延缓衰老和抗辐射损伤等重要的生物学功能[11-14]。

目前所利用的原花青素主要来自葡萄籽及海松皮提取物[15],对葡萄、海松树等单一资源的依赖严重制约了我国原花青素产业的发展[16]。而我国爬山虎资源丰富,品质天然、无污染,是提取原花青素的重要潜在资源物质[17]。如能有效综合开发与利用我国丰富的爬山虎资源,对提升我国原花青素产业的国际竞争力有重要意义。

本研究通过单因素试验考察了提取温度、提取时间、液料比和乙醇体积分数对爬山虎果实中原花青素得率的影响;通过响应面法进行优化,以期得到爬山虎果实中原花青素的最佳提取工艺,为爬山虎的综合开发与利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

爬山虎果实 由湖南省林产化工工程重点实验室提供,采自吉首大学张家界校区后山(经测定为葡萄科爬山虎属植物爬山虎);甲醇、香草醛、石油醚、氢氧化钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇 分析纯,广东市光华化学厂;浓盐酸 分析纯,衡阳市凯信化工试剂有限公司;乙酸乙酯 分析纯,天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

微型植物粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司;KQ-A玻璃仪器气流烘干器 北京中兴科学仪器公司;HH.S11-4型数显电热恒温水浴锅 上海岚洋自动化系统工程有限公司;DHG-9070型电热恒温鼓风干燥箱 上海精密实验设备有限公司;RE-2000型旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司;SHB-II多用循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂;紫外-可见分光光度检测器:Agilent8453;AUW220D精密电子天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司;真空冷冻干燥器。

1.2 实验方法

1.2.2 原花青素提取工艺路线 脱脂后的干爬山虎果实粗粉→乙醇回流提取→抽滤→滤液减压浓缩→烘干(47 ℃ 20 h)→水溶解除杂→抽滤→石油醚萃取(石油醚∶抽滤后的原料=1∶1,30 min)→分离醚相,将石油醚水浴挥发出来→乙酸乙酯萃取(乙酸乙酯∶水浴后的原料=1∶1,30 min)→加蒸馏水挥去乙酸乙酯→预冻(-80 ℃,1 h)→真空冷冻干燥(-80 ℃)→原花青素粉末[18-19]。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 提取温度对原花青素得率的影响 称取7组,每组3.0 g的脱脂后的果实粗粉,溶解在体积分数为70%的乙醇溶液中,控制液料比为20∶1 mL/g,调整pH至5.0[21];置于恒温水浴锅中,分别在30、40、50、60、70、80、90 ℃下提取1 h;平行三次。测定并计算原花青素得率。

1.2.3.2 提取时间对原花青素得率的影响 称取7组,每组3.0 g的脱脂后的果实粗粉,溶解在体积分数为70%的乙醇溶液中,控制液料比为20∶1 mL/g,调整pH至5.0;置于恒温水浴锅中,在70 ℃恒温条件下,分别提取30、50、70、90、110、130、150 min;平行三次。测定并计算原花青素得率。

1.2.3.3 乙醇体积分数对原花青素得率的影响 称取6组,每组3.0 g的脱脂后的果实粗粉,溶解在体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液中,控制液料比为20∶1 mL/g,调整pH至5.0;置于恒温水浴锅中,在70 ℃恒温条件下提取1 h;平行3次,测定并计算原花青素得率。。

1.2.3.4 液料比对原花青素得率的影响 称取6组,每组3.0 g的脱脂后的果实粗粉,溶解在体积分数为70%的乙醇溶液中,控制液料比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g,调整pH至5.0;置于恒温水浴锅中,在70 ℃恒温条件下,提取1 h;平行3次,测定并计算原花青素得率。

1.2.3.5 重复提取次数对原花青素得率的影响 称取4组,每组3.0 g的脱脂后的果实粗粉,溶解在体积分数为70%的乙醇溶液中,控制液料比为20∶1 mL/g,调整pH至5.0;置于恒温水浴锅中,在70 ℃恒温条件下,提取时间1 h,分别提取1、2、3、4次;平行三次。测定并计算原花青素得率。。

在农作物的生长过程中，不单单只有土壤以及肥料会对农作物的产量造成影响，同时其相关的种植模式也会对其生长造成一定的影响。就比如，在选择农作物的种类进行种植时，如果不能充分的考虑农作物的间套种植，那么其相关的光温及肥料的吸收和利用率就必然会受到严重的影响。因此农业工作人员一定要选择科学合理的种植模式，不能单单只是进行一种农作物的种植，进而对土地进行充分的利用。

1.2.4 提取工艺条件的响应面法优化试验 综合单因素实验及正交试验结果,选取对原花青素得率影响较大的4个因素,即:提取温度、提取时间、乙醇体积分数和液料比,分别以X1、X2、X3和X4表示(表1)。以X1、X2、X3和X4为自变量,以原花青素得率为响应值(Y)进行试验。采用Design-Expert 7.0对实验数据进行回归分析。每一自变量的低、中、高实验水平分别以-1、0、1进行编码。

表1 响应曲面设计实验因素水平和编码Table 1 Independent variables and their levelsused in the response surface design

1.2.5 原花青素含量测定 原花青素含量的测定采用香草醛-盐酸比色法[20]

1.2.5.1 原花青素标准曲线的制作 分别取1 mg/mL原花青素标准液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于10 mL具塞容量瓶中,依次加入6 mL A液(4%香草醛甲醇溶液),3 mL B液(浓盐酸),用甲醇定容至10 mL,摇匀;空白对照为A液∶B液∶甲醇=6∶3∶1 (V∶V∶V)。30 ℃避光水浴20 min,反应期间轻轻晃动数次。反应结束后,冷却至室温,摇匀,用Agilent8453紫外分光光度计,测520 nm处吸光值。以原花青素浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.5.2 样品中原花青素含量测定 取1 mL甲醇复溶后的原花青素样品按照上述方法进行反应,反应结束后用Agilent8453紫外分光光度计,测520 nm处吸光值。根据标准曲线计算样品中原花青素浓度,并利用下式计算原花青素得率:

其中,C为测得的原花青素浓度,mg/mL;V为样品定容体积mL;n为样品稀释倍数;m为干爬山虎果实粗粉质量mg。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

如图1所示,标准曲线回归方程为y=6.7592+0.0283(R2=0.9984)。结果表明,原花青素在0.01～0.06 mg/mL范围内与520 nm处吸光值线性关系良好。

图1 原花青素标准曲线Fig.1 Standard curve of proanthocyanidins

2.2 单因素实验结果

2.2.1 提取温度对原花青素得率的影响 如图2所示,在30～70 ℃范围内,原花青素得率随着温度升高而增大,超过70 ℃后,原花青素得率却随着温度的升高而降低,这是由于原花青素极易氧化,温度越高,原花青素有效成分的结构被破坏的程度就越大,活性成分损失的就越多。并且高温下固体原料本身会起化学变化,使杂质溶出增多,因而会降低原花青素得率。

图2 提取温度对原花青素得率的影响Fig.2 Effect of different extractiontemperature on extraction rate

2.2.2 提取时间对原花青素得率的影响 由图3可知,提取时间为30～70 min时,原花青素得率随着时间增加而增大,70 min处达到最大值;之后随提取时间的延长,原花青素得率开始逐渐下降。提取时间过短,原花青素来不及溶出,提取时间过长,酚类物质易被破坏[22]。

图3 提取时间对原花青素得率的影响Fig.3 Effect of different extraction time on extraction rate

2.2.3 乙醇体积分数对原花青素得率的影响 如图4可知,当乙醇体积分数为40%～70% 时,随着乙醇浓度增大,原花青素得率相应增加;当乙醇体积分数达到60%时,提取量也达到最高值。当乙醇体积分数大于60%时,原花青素得率开始下降。这是由于乙醇浓度不同,浸提溶剂极性大小不同,因此其对原花青素的溶出效果有不同影响。原花青素是一种多酚类物质,含较多羟基且具有一定极性,依据相似相溶的原理,当溶剂极性和原花青素极性相当时,溶解度达到最大,同时,得率最多,随着乙醇浓度进一步增加,其中,一部分醇溶性成分溶出,同原花青素竞争与乙醇的结合,会导致原花青素提取得率下降[23]。因此选择合适的醇/水比例尤为关键。

图4 乙醇体积分数对原花青素得率的影响Fig.4 Effect of different ethanol concentration on extraction rate

2.2.4 液料比对原花青素得率的影响 由图5可知,液料比在5∶1～15∶1 mL/g范围内,原花青素得率随着溶剂的增加而增加。在15∶1～30∶1 mL/g内原花青素得率增加缓慢。在实际生产中,如果液料比较大,不仅会消耗较多的溶剂,而且会降低原花青素的浓度,在后续的操作过程中需要消耗更多的能源,因而,液料比取15∶1较好。

图5 液料比对原花青素得率的影响Fig.5 Effect of different solid to liquid ratio on extraction rate

2.2.5 重复提取次数对原花青素得率的影响 由图6可知,提取次数的增多能增加提取总量。提取1次以后,材料中原花青素得率明显降低;提取2次之后,材料中原花青素得率已经很低了,提取3次之后,材料中原花青素得率已经接近零了。综合考虑到能源消耗、设备占用和劳动力成本,提取1次较好。

图6 重复提取次数对原花青素得率的影响Fig.6 Effect of different extract times on extraction rate

2.3 响应面实验结果与分析

2.3.1 响应面法优化原花青素提取工艺 根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理,综合单因素试验结果,选取对原花青素得率影响较大的4个因素,即:提取温度、提取时间、乙醇体积分数和液料比,分别以X1、X2、X3和X4表示。试验因素和水平设计见表1。以X1、X2、X3和X4为自变量,以爬山虎果实原花青素得率为响应值(Y)进行试验。试验方案及结果见表2。表2共27个试验点,其中7、11、14是中心试验,其余为析因试验。析因点为自变量取值在X1、X2、X3和X4所构成的顶点,零点为区域的中心点,其中零点试验重复3次,用以估算试验误差。

表2 响应面分析法结果Table 2 Results of response surface analysis

2.3.2 模型的建立与显著性检验 采用Design-Expert 10对所得的实验结果进行多元回归分析,分析结果见表3。由于各因素对原花青素的得率的影响不是简单的线性关系,为了明确各因子对相应值的影响,使用Design Expert 10,对表3中原花青素得率进行回归拟合,获得二次多项回归方程:

从表3的分析结果来看,模型的P值小于0.0001,表明该二次方程模型达到极显著水平;失拟项0.6999远远大于0.05,表明该项不显著,由此可说明该方程对试验拟合较好,自变量与响应值之间线性关系良好,可以用于原花青素得率的理论值的预测。

表3 回归分析结果Table 3 Results of variance analysis

由表3可知,提取温度、乙醇体积分数的一次项,提取温度、提取时间与乙醇体积分数的二次项,提取温度与提取时间交互项,提取温度与乙醇体积分数交互项均达到高度显著水平P<0.0001;液料比的一次项,乙醇体积分数与液料比的交互项达到极显著水平(P<0.01);液料比二次项,提取温度与液料比的交互项达到显著水平(P<0.05)。由F值可知,各因素对原花青素得率的影响次序为:提取温度>乙醇体积分数>液料比>提取时间。

2.3.3 交互作用分析 从Design Expert10软件中可得到各因素X1、X2、X3、X4对响应值原花青素得率Y所构成的三维空间曲面图,用来反映各因素与响应值之间的影响作用。曲面越陡峭,表示变化越急剧,作用越明显,曲面颜色也呈加深趋势。交互效应强弱程度可从等高线的形状中观察,圆形为交互作用不显著,椭圆则为交互作用显著[24]。此外,在一定范围内,等高线图中等高线的疏密或条数也是判断交互作用显著与否的一个重要标准[25]。

从图7a～图9a,图12a中可以看出,曲面倾斜度比较大,且越接近曲面顶端时,颜色愈深,说明相关两因素间交互作用对响应值的影响显著。而图10～图11中曲面的变化相对平缓,说明相关两因素间交互作用对响应值的影响不明显。

图7 提取温度与提取时间对原花青素得率影响的响应面图Fig.7 Response surface plots of extraction temperature and extraction time on the proanthocyanidin extraction rate

图8 提取温度与乙醇体积分数对原花青素得率影响的响应面图Fig.8 Response surface plots of extraction temperature and concentration of ethanol on the proanthocyanidin extraction rate

图9 提取温度与液料比对原花青素得率影响的响应面图Fig.9 Response surface plots of extraction temperature and material quality concentration on the proanthocyanidin extraction rate

图10 提取时间与乙醇体积分数对原花青素得率影响的响应面图Fig.10 Response surface plots of extraction time and concentration of ethanol on the proanthocyanidin extraction rate

图11 提取时间与液料比对原花青素得率影响的响应面图Fig.11 Response surface plots of extraction time and material quality concentration on the proanthocyanidin extraction rate

图12 液料比与乙醇体积分数对原花青素得率影响的响应面图Fig.12 Response surface plots of material quality concentration and concentration of ethanol on proanthocyanidin extraction rate

从图7b～图9b,图12b可以看出,各图等高线基本接近椭圆形,故相关两因素之间均存在交互作用。以图9b为例,取提取温度X1的三个水平进行等高线图分析。在-1到0之间时,等高线条数明显多于0到1之间,且越接近0水平,等高线越稀疏,相邻等高线之间跨度越大;在0到1之间,等高线条数仅为1条。结果表明,一定范围内,等高线越密集,曲面变化率越小,交互作用对响应值的影响越不显著。反之,等高线越稀疏,则表示交互作用对响应值的影响越显著。

2.3.4 最佳提取工艺条件的确定 结合回归模型的数学分析可知,乙醇回流法提取爬山虎果实原花青素的最佳工艺参数为:提取温度75.87 ℃,提取时间74.12 min,乙醇体积分数55.71%,液料比20∶1。在此工艺条件下爬山虎果实原花青素的理论得率为3.8166%。为检验RSA法的可靠性,采用上述最佳提取条件进行验证试验。考虑到实际操作条件,将最佳提取条件修正为:提取温度76 ℃,提取时间74 min,乙醇体积分数56%,液料比20∶1,实际测得的原花青素得率为3.8214%±0.2287%,稍高于理论预测值3.8166%。此结果说明实际实验值与软件预测值吻合度良好,证明此优化方案可行,在实际应用中具有可操作性。

3 结论

单因素实验以提取温度、提取时间、乙醇体积分数、液料比和重复提取次数为单因素,采用乙醇回流提取法考察其对原花青素得率的影响。结果表明,这几个因素对原花青素得率都有明显影响。结合单因素结果,本研究采用响应面分析法进一步优化爬山虎果实中原花青素的提取工艺研究,以提取温度、提取时间、乙醇体积分数和液料比为主要因素进行中心组合试验,建立了原花青素含量预测方程。实验结果表明,提取温度、乙醇体积分数的一次项,提取温度、提取时间与乙醇体积分数的二次项,提取温度与提取时间交互项,提取温度与乙醇体积分数交互项均达到高度显著水平(P<0.0001);液料比的一次项,乙醇体积分数与液料比的交互项达到极显著水平(P<0.01);液料比二次项,提取温度与液料比的交互项对响应值的影响达到显著水平(P<0.05)。当提取工艺条件为提取温度76 ℃,提取时间74 min,乙醇体积分数56%,液料比20∶1,提取1次时,原花青素含量达到极大值3.8214%,与理论预测值接近。说明响应面分析法优化爬山虎果实中原花青素的提取工艺可行。