方格星虫纤溶酶抗血栓作用研究

黄晓亮,李福森,陈铭洁,谢国涛,蒙湄方,李映新

(广西医科大学药学院,广西南宁 530021)

方格星虫(Sipunculusnudus)亦称光裸方格星虫,俗称“沙虫”,为星虫动物门(Sipuncula)、星虫纲(Sipunculidea)、方格星虫属(Sipunculus),其中以广西北部湾海域的自然资源最丰富。方格星虫营养丰富、肉质脆嫩、鲜美甘甜,有滋阴降火之功效,东南沿海居民称其为“海洋冬虫夏草”,具有药食两用的价值[1-3]。过去国内外研究方格星虫主要集中在生长、生殖、生理、生态等方面,药用价值的研究较少,但近几年来,关于其有效成分及药理作用的报道也逐年增加。目前主要发现方格星虫富含多糖、多肽等成分,具有抗疲劳、抗氧化、抗病毒、提高免疫力等药理活性[4-5]。

方格星虫纤溶酶(SNFE)是本课题组从方格星虫内脏中提取分离的一种丝氨酸蛋白酶(专利号:ZL201010210919.5),相对分子质量33.25 kD,在对其开展的一系列研究中发现,SNFE兼具激酶及直接溶解纤维蛋白的活性,在体外具有良好的溶栓和抑制二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集作用,在体内能延长小鼠的出血时间和凝血时间,显示其在抗血栓方面具有良好的研究和应用前景[6-8]。

角叉菜胶诱导的鼠科动物血栓模型是研究抗栓药物常用的一种动物模型,利用角叉菜胶强烈的致炎作用刺激炎症因子释放从而损伤血管内皮细胞,进而破坏正常血管内皮维持凝血和纤溶的动态平衡的功能引发血栓[9-10]。该实验操作相对简单,且血栓出现在尾部,易于观察和测量,适合对血栓形成或者溶解过程的动态观察[11-12]。

本文通过在体外测定SNFE对花生四烯酸(AA)诱导的血小板聚集的抑制率,在体内建立角叉菜胶诱导的小鼠静脉血栓模型,观察SNFE对黑尾发生率、黑尾相对长度以及对凝血四项指标,即血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)以及纤维蛋白原(FIB)的影响,初步评价SNFE的抗血栓用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

8周龄SPF级SD大鼠(体重(200±20) g,雌雄不限)、4周龄SPF级昆明小鼠(体重(20±2) g,雄雌各半) 动物生产许可证:SCXK(桂)2014-0002,动物使用许可证:SYXK(桂)2014-0003,广西医科大学实验动物中心提供;花生四烯酸(100 mg)、角叉菜胶(25 g) Sigma公司,阿司匹林肠溶片 亚宝药业;凝血酶原时间(PT)测定试剂盒、活化部分凝血酶时间(APTT)测定试剂盒、凝血酶时间(TT)测定试剂盒、纤维蛋白原(FIB)测定试剂盒 上海太阳生物技术有限公司。

ME204E电子分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;560CA全血小板聚集仪 美国Chrono-Log公司;MC-100血凝仪 德国美创公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SNFE的提取及活性测定 提取方法参照文献[6],酶活力测定按照纤维蛋白平板法,以尿激酶为对照,得到标准曲线,Y(溶酶圈面积)=0.0012X(酶活力)+0.5667(r=0.9986),根据标准曲线计算酶活力为50 IU/mg。SNFE冻干粉存于-20 ℃冰箱保存,临用前根据实验所需浓度用生理盐水配制使用。

1.2.2 SNFE对花生四烯酸诱导血小板聚集的影响 大鼠麻醉后腹主动脉采血,全血用枸橼酸钠抗凝并以800 r/min离心10 min,吸取上层血浆为富血小板血浆(PRP),继续以3000 r/min离10 min,取上层液为贫血小板血浆(PPP)。在测试杯中加入搅拌珠、280 μL的PRP及高、低浓度的10 μL SNFE溶液;阳性对照组以等体积的阿司匹林溶液(0.50 mg/mL)加入;空白对照组以等体积的生理盐水加入。孵育3 min后,放入测试通道,加10 μL的花生四烯酸(AA)至终浓度为0.2 mmol/L,PPP调零并用血小板聚集仪测定空白对照管和给药管血小板5 min内的最大聚集率(PAGM),每个浓度设5管平行对照。并按下述公式计算药物对血小板聚集的抑制率(AIP)。

AIP(%)=(PAGM空白对照组-PAGM给药组)/PAGM空白对照组×100

1.2.3 SNFE对角叉菜胶诱导血栓的影响 小鼠适应性饲养3 d后,随机分成空白组、模型组、阿司匹林组(10 mg/kg)、SNFE低剂量组(4000 IU/kg)、SNFE高剂量组(8000 IU/kg),每组10只。除给药组外,空白组和模型组给予生理盐水,按照0.2 mL/10 g的容积每天上午灌胃给药一次,每7 d称体重一次并调整给药量。灌胃第12 d,除空白组外,腰背部皮下按照0.1 mL/10 g注射0.8%角叉菜胶。继续给药2 d,在此期间观察造模后24及48 h形成黑尾情况(尾静脉血栓造模成功的判定方法:尾部形成暗红色血栓),记录形成黑尾的小鼠只数,并用直尺测量鼠尾长度及血栓的长度(从鼠尾末端到形成暗红色血栓前沿的长度),按照血栓形成相对长度=尾部血栓长度/鼠尾长度,计算小鼠血栓形成相对长度。末次药后2 h行拔眼球采血0.5～0.8 mL,用3.8%枸橼酸钠抗凝(9∶1)处理,3000 r/min 离心15 min,取上层血浆。按照试剂盒说明,采用全自动血凝仪测定血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)及纤维蛋白原(FIB)。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 SNFE对花生四烯酸诱导血小板聚集的影响

AA途径是血小板聚集的三个途径之一,表1结果表明,与空白组比较,SNFE高、低剂量组均能降低AA诱导的血小板5 min内最大聚集率,且高剂量组的差异有统计学意义(P<0.01),低剂量组SNFE虽然也有抑制作用,但效果不显著,说明SNFE和纳豆激酶一样[11],对AA诱导的血小板聚集的抑制作用具有一定量效关系。环氧化酶抑制剂阿司匹林直接阻断AA途径,效果最为显著,高于SNFE组的抑制效果(P<0.01),推测可能是因为SNFE对AA途径的作用是间接作用而非直接作用。

表1 SNFE对AA诱导血小板聚集率的影响(n=5)Table 1 Effect of SNFE on plateletaggregation induced by AA(n=5)

2.2 SNFE对角叉菜胶诱导的小鼠尾静脉血栓的影响

注射角叉菜胶24 h后,仅个别小鼠尾巴尖部开始有约0.3～0.5 cm暗红色血栓形成,大部分小鼠没有黑尾出现,故未做统计。48 h后,注射角叉菜胶的各组大部分均出现从尾尖到尾根延伸的不同长度黑尾,界限明显,通过直尺直接体表测量可知血栓长度。其中模型组和SNFE低剂量组的黑尾发生率(即每组发生黑尾的小鼠只数/每组小鼠总只数)为90%,SNFE高剂量组的黑尾发生率降低至60%;模型组的黑尾相对长度最长,SNFE高、低剂量组均有不同程度降低,但仅高剂量组有统计学差异(P<0.05),结果见表2。

表2 SNFE对角叉菜胶诱导的血栓形成的影响(n=10)Table 2 The effect of SNFE on carrageenaninduced tail-thrombus mice(n=10)

2.3 角叉菜胶致血栓小鼠凝血功能的影响

造模48 h后,模型组小鼠的PT、APTT、TT缩短,与空白组比较,有显著差异(P<0.05);模型组FIB含量增加,但与空白组比较无显著差异(P>0.05)。SNFE高、低剂量组的PT、APTT、TT在数值上均比模型组增加,FIB含量减少,但仅高剂量组的APTT、TT的延长有统计学意义(P<0.01或0.05);与空白组比较,SNFE各剂量组APTT以及高剂量组TT无显著差异(P>0.05),说明SNFE可以使血栓小鼠的部分凝血功能指标恢复正常水平,结果见表3。

表3 SNFE对角叉菜胶致血栓小鼠凝血功能的影响(n=10)Table 3 Effect of SNFE on the blood coagulation function of carrageenan-induced thrombosis mice(n=10)

2.4 对小鼠体重的影响

如表4,喂养14 d内,各组小鼠饮食及活动均正常,无死亡,平均体重均处于逐日增长的状态。实验分组前,各组小鼠体重无显著差异(P>0.05);喂养7 d后的SNFE高剂量组与同期空白组、模型组的体重比较显著增加(P<0.05)。14 d后的SNFE各组小鼠体重均比同期空白组、模型组的体重显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)增加,说明SNFE对小鼠有增加体重的作用,其机理有待研究。

表4 SNFE对小鼠体重的影响(n=10)Table 4 Effects of SNFE on weights of mice(n=10)

3 讨论与结论

血栓是血液成分在流动过程中,在血管或心脏内膜表面形成一种半凝块状物质,由不溶性纤维蛋白、沉积的血小板、积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。在可变的流体依赖型中,血栓血液中存在相互拮抗的凝血系统和纤维蛋白溶解系统(即抗凝血系统)。在正常的生理状态下,凝血系统和抗凝血系统保持着动态平衡,即保证血液有潜在的凝固性又保证了血液的流体状态。但是,当在某些因素作用下,打破了凝血系统和抗凝血系统的动态平衡,触发了凝血过程,血液便在心血管腔内凝固,从而形成血栓[12]。因此,血栓的形成与凝血系统和纤维蛋白溶解系统密切相关,许多抗血栓药物不是具备抗凝血作用,便是具有纤维蛋白溶解活性,而血小板的活化、黏附、聚集是血栓形成的重要步骤[13]。因此,本文首先研究SNFE在体外对花生四烯酸(AA)诱导血小板聚集的抑制作用,继而建立血栓模型,测定SNFE对凝血系统的影响。

花生四烯酸(AA)是除了ADP外常用的血小板聚集诱导剂,它经环氧化酶途径在血栓素合成酶作用下生成的代谢产物血栓素A2(TXA2)是血小板强烈的促聚剂[14],而阿司匹林可通过抑制血小板环氧化酶-1,抑制花生四烯酸的代谢,使TXA2生成减少而抗血栓。实验结果显示,SNFE在体外有抑制AA诱导的血小板聚集作用,但该作用弱于阿司匹林,估计是SNFE间接影响了AA代谢过程的某个环节,有待于后续实验给予明确。

角叉菜胶诱导的鼠类血栓模型是研究抗血栓药物常用模型,其疾病机理主要利用角叉菜胶的强致炎作用及鼠尾血液循环较差的特点,该实验不需要进行手术从而避免对动物造成伤害,适用于饮食或预防性的血栓治疗效果观察[15-17]。在实验中发现,温度对模型成功与否有很大影响,使小鼠处于20 ℃的空调环境下,能够容易形成血栓,而高温不利于血栓出现,可能是由于低温使尾部血液更易于循环不畅造成血栓。本实验模型组黑尾发生率为90%,说明造模是成功的,但血栓在造模后48 h才明显,根据文献报道[18],湿度对模型成栓也有很大影响,本实验成栓时间晚可能与实验期间处于夏季高温,环境湿度较小有关。SNFE高剂量组预防性给药后造模,黑尾发生率和黑尾相对长度均比模型组降低,说明SNFE有一定的抑制血栓形成的作用。

为了探讨抗血栓的作用机理,本实验测定了凝血系统功能指标,凝血四项即PT、APTT、TT、FIB是检测凝血系统功能是否正常最常用的敏感而重要的指标。PT和APTT分别反应外源性、内源性凝血系统状况(凝血因子含量及活性改变);TT反应共同凝血途径中,纤维蛋白原转化为纤维蛋白的时间,由于纤维蛋白原的降解产物FDP能使TT延长,因此TT也作为纤溶系统的筛选实验;FIB反应纤维蛋白原的含量,而纤维蛋白原是血液中含量最高的凝血蛋白,影响血液的黏度并作为凝血因子直接参与凝血过程[19]。本实验中,SNFE高剂量组能使APTT、TT延长,甚至使模型小鼠的部分指标恢复正常水平,说明SNFE抑制角叉菜胶诱导的血栓形成作用与影响内源性凝血系统及延长纤维蛋白原转化为纤维蛋白的时间有关。SNFE灌胃2周不仅没有影响小鼠体重增长,反而增长比模型组及空白组快,具体机制还有待于实验研究。

综上所述,SNFE体外抑制AA诱导的血小板聚集并且预防性给药能抑制角叉菜胶诱导的小鼠血栓形成,其作用机制与影响内源性凝血系统及延长纤维蛋白原转化为纤维蛋白的时间有关,其他作用机制还有待于进一步深入探讨。